Диссертация (1145883), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Круги обозначают молекулы Sfp1p в нативной конформации, звёзды — в прионной конформации, зачёркнутоеобозначение SFP1 — делецию этого гена.Эти данные позволили предположить, что SFP1 является структурным геном [ISP+ ], и поэтому белок Sfp1 был подвергнут дополнительной проверке. Было показано, что белок Sfp1-GFP, продуцирующийся с центромерной плазмидыпод контролем промотора SFP1, образует фокусы флуоресценции, совпадающиепо расположению с ядром, в 5-7% клеток в случае клонов [ISP+ ], но не в случаеклонов [isp- ]; в последнем случае наблюдали слабое свечение, также локализованное в ядре. При сверхпродукции Sfp1-GFP под контролем индуцируемогогалактозой промотора в клетках [ISP+ ] также были зарегистрированы фокусыфлуоресценции.
Наконец, при анализе с помощью дифференциального центрифугирования белковых лизатов клеток, продуцирующих Sfp1-GFP, обнаружили,что в клетках [ISP+ ] белок Sfp1-GFP распределён между низкомолекулярной ивысокомолекулярной фракциями, в то время как в клетках [isp- ] он находитсятолько в низкомолекулярной фракции (Rogoza et al., 2010).Совокупность этих данных позволила предположить, что в клетках [ISP+ ]Sfp1p находится в составе амилоидных агрегатов, которые теряются при делеции SFP1, но могут вторично возникать после возобновления экспрессии SFP1(см. рис. 1.12).
Это предположение подкреплялось потенциальной амилоидогенностью белка Sfp1 (см. 1.4.1).Связь между регулятором транскрипции SFP1 и эффективностью нонсенссупрессии оставалась не вполне понятной. Недавно мы показали, что сверхэкспрессия SFP1 снижает эффективность нонсенс-супрессии, вызванной некоторы-49ми мутациями sup45, и повышает эффективность супрессии, вызванной присутствием [PSI + ]; возможно, что в обоих случаях эффект связан с увеличением количества Sup35p при сверхэкспрессии SFP1 (Дроздова и др., 2013; Matveenko etal., 2016). Поскольку фактор [ISP+ ] исходно обнаружен как модификатор супрессии, вызванной мутациями sup35, можно предположить, что Sup35p опосредуетвлияние Sfp1p на эффективность нонсенс-супрессии.
Действительно, мы показали, что при делеции SFP1 экспрессия гена SUP35 и уровень его продукта снижены, а в штаммах [ISP+ ] — повышены по сравнению со штаммом [isp- ] (Radchenkoet al., 2011). Тем не менее, полученные данные не позволяют ни утверждать, чтоуровень экспрессии гена SUP35 является основным фактором, определяющимразницу в эффективности нонсенс-супрессии у клонов Isp+ и Isp– , ни говорить онепосредственной транскрипционной регуляции гена SUP35 белком Sfp1.1.5. ЗаключениеНакопленные данные показывают, что эффективность терминации трансляции подвергается очень тонкому контролю, который осуществляют нескольковзаимодействующих систем. Дополнительный уровень сложности этой системе добавляет то, что эффективность терминации трансляции обычно оцениваютпо фенотипическому проявлению нонсенс-супрессии (например, по способностиштаммов обходиться без вещества, в одном из генов пути биосинтеза которогоесть нонсенс-мутация).Изменять эффективность терминации трансляции в совместимых с жизнью дрожжевой клетки пределах могут не только мутации в генах, продуктыкоторых осуществляют этот процесс, но и (иногда с не меньшей силой) мутациив других генах, а также посттрансляционные модификации их продуктов и изменение дозы генов за счёт анеуплоидии.
Особый интерес представляет описанноеранее обратимое изменение эффективности супрессии нонсенс-мутаций his7-1 иlys2-87 у некоторых производных штамма 2В-П3982. Для этого явления показано сходство с дрожжевыми прионами и связь с белками Hal3 и Sfp1, однако общий механизм его формирования не выявлен. В этой работе для характеристики50фенотипа клонов штамма 25-25-2В-П3982 мы будем использовать обозначениеIsp+ /Isp– , где Isp+ соответствует несупрессорному фенотипу, т.
е. неспособностирасти на средах без лизина или гистидина, а Isp– — супрессорному фенотипу, т. е.способности расти на этих средах.Целью работы явилось дальнейшее изучение механизмов, лежащих в основе обратимой инверсии супрессорного фенотипа (Isp) у дрожжей S. cerevisiae.В рамках поставленной цели были сформулированы следующие задачи:1. Изучение влияния сверхэкспрессии генов, кодирующих известные прионногенные регуляторы транскрипции, на частоту появления клонов Isp+ впотомстве клонов Isp– ;2. Сравнение изменения экспрессии генов, сопровождающего переход от фенотипа Isp+ к фенотипу Isp– , с изменением экспрессии, вызванным делециейSFP1;3. Поиск генов, изменение уровня экспрессии которых может определять разницу фенотипов Isp+ и Isp– ;4.
Анализ кариотипа независимо полученных клонов Isp+ и Isp– , направленный на выявление особенностей, коррелирующих с фенотипом клона.51Глава 2. Материалы и методы2.1. ШтаммыИспользованные в работе штаммы S. cerevisiae перечислены в табл. 2.1.Таблица 2.1 — Характеристика использованных в работе штаммов S.
cerevisiae.Название штам- ГенотипИсточникмаP-2В-П3982МАТα ade1-14 his7-1 lys2-87 ura3Δ Volkov et al., 2002leu2-B2 thr4-B15 [PSI + ]2-P-2В-П3982МАТα ade1-14 his7-1 lys2-87 ura3Δ Данная работаleu2-B2 thr4-B15 sup35-25 sup45-400[psi– ]25-2В-П3982МАТα ade1-14 his7-1 lys2-87 ura3Δ Волков и др., 1997;leu2-B2 thr4-B15 sup35-25 sup45-400 Volkov et al., 200215В-П4MATaИнге-Вечтомов, 1963S1 (S288C)MATαMortimer,Johnston,1986; Strope et al., 201525-25-2В-П3982∗ МАТa ade1-14 his7-1 lys2-87 ura3Δ Аксенова и др., 2006leu2-B2 thr4-B15 sup35-25 sup45-400hsp104Δ-m2-МАТa ade1-14 his7-1 lys2-87 ura3Δ Данная работа25-25-2В-П3982 leu2-B2 thr4-B15 sup35-25 sup45-400HSP104::hygBcrf1Δ-p3-МАТa ade1-14 his7-1 lys2-87 ura3Δ Данная работа25-25-2В-П3982† leu2-B2 thr4-B15 sup35-25 sup45-400CRF1::kanMXcrf1Δ-m2-МАТa ade1-14 his7-1 lys2-87 ura3Δ Данная работа25-25-2В-П3982† leu2-B2 thr4-B15 sup35-25 sup45-400CRF1::kanMX52rps9AΔ-p3-МАТa ade1-14 his7-1 lys2-87 ura3Δ Данная работа25-25-2В-П3982† leu2-B2 thr4-B15 sup35-25 sup45-400RPS9A::kanMX2Г-П2345ПГЛ (см.
Коченова иMATa his5др., 2011)78А-П2345ПГЛ (см. Коченова иMATα his5др., 2011)1Б-Д1606∗MATαade1-14his7-1lys9-A21 Moskalenko et al., 2003trp1-289 ura3-52 leu2-3,112 gal10-1Bsfp1Δ-1Б-Д1606 MATαade1-14his7-1lys9-A21 Получен А. Б. Данило-trp1-289 ura3-52 leu2-3,112 gal10-1B вой, описан в: Радченsfp1Δко, 2014Генотипы приведены согласно опубликованным данным с необходимыми уточнениями.Все штаммы являются гетероталличными, поскольку содержат неактивную аллель гена HO.Использованы стандартные обозначения мутаций и идиоморфов MAT.
Аллели his7-1и lys9-A21 содержат преждевременный стоп-кодон UAA (Самбук, Тер-Аванесян, 1980;Chabelskaya et al., 2007), аллели ade1-14, lys2-87 и thr4-B15 — UGA (Инге-Вечтомов и др.,1988; Bertram et al., 2000), а аллель trp1-289 — UAG (Chabelskaya et al., 2007); эти мутации приводят к ауксотрофности по гистидину, лизину, аденину, лизину, треонину и триптофану соответственно. Миссенс-мутация leu2-B2 (см. ниже) и инсерция двух гуаниловыхнуклеотидов (leu2-3,112; Meira et al., 1995) приводят к ауксотрофности по лейцину и позволяют использовать плазмидные вектора с селективным маркером LEU2.
Полная делециягена URA3 (ura3Δ, см. ниже) и вставка транспозона (ura3-52; Rose, Winston, 1984) приводятк ауксотрофности по урацилу и позволяют использовать ген URA3 в качестве селективногомаркера. Миссенс-мутация sup35-25 приводит к омнипотентной нонсенс-супрессии (Volkovet al., 2002), миссенс-мутация sup45-400 не обладает собственным фенотипическим проявлением (Аксенова и др., 2006).Полное название штамма 2В-П3982 — ду8-132-Л28-2В-П3982. В работе использовано сокращённое название 2В-П3982 для всех его производных.∗Полные сведения об однонуклеотидных заменах, отличающих геномы этих штаммовот генома S288C, доступны в геномном браузере UCSC (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgHubConnect#publicHubs, Peterhof_yeasts; Drozdova et al., 2016).†Получено несколько аналогичных штаммов, см.
ниже.В рамках этой работы клоном мы будем называть совокупность клеток,происходящих из одной колонии, изолятом — группу клонов одного фенотипа,53полученную в результате одного события изменения фенотипа предкового клона,а штаммом — группу изолятов одного базового генотипа (без учёта копийностихромосом), т. е. мы допускаем, что клоны одного штамма могут различаться пофенотипу.Для амплификации плазмид использован штамм DH5α Escherichia сoliследующего генотипа: supE44 ΔlacU169 (80 lacZΔM15) hsdR17 recA1 endA1gyrA96 thi-1 relA1 (Sambrook et al., 1989).2.2.
Среды и методы культивированияДрожжевые клетки хранили в смеси, включавшей 70% (v/v) YEPD и 15%(v/v) глицерина (Kaiser et al., 1994) при температуре не выше -65 °C (за исключением случаев технической неисправности морозильного оборудования). Каждуюзамороженную аликвоту суспензии клонов фенотипа Isp– использовали не более2 раз, клонов фенотипа Isp+ — не более 4 раз.Если не указано иного, то дрожжевые штаммы инкубировали при температуре 26 °C при наличии мутаций sup35 и sup45 или при 30 °C при отсутствиитаких мутаций, а регистрацию фенотипа проводили на пятый или шестой день.Для выращивания дрожжей в неселективных условиях использовали полную среду YEPD (Kaiser et al., 1994). При выращивании жидких культур длявыделения геномной ДНК в YEPD добавляли 100 мг/л аденина, чтобы предотвратить продукцию красного пигмента, который затруднительно впоследствииотделить от ДНК. Для определения активности кислой фосфатазы использовали жидкую среду ПЕПФО (Захаров и др., 1984) со следующим изменением:для ингибирования активности ингибируемой кислой фосфатазы добавляли 1г/л K2 HPO4 .
Для отбора клонов Isp– и анализа чувствительности в среды добавляли гидрохлорид гуанидина (GuHCl) в конечной концентрации 5 мМ. Дляотбора клонов, в геноме которых произошло замещение изучаемого гена на генустойчивости к антибиотику, и их дальнейшей проверки использовали среды наоснове YEPD, содержащие от 100 до 200 мг/л генетицина (G418) или от 100 до54300 мг/л гигромицина B. Для определения дыхательной компетентности штаммаиспользовали среду СПГ (Захаров и др., 1984).Для анализа фенотипа и выращивания культур в селективных условиях применяли синтетические среды: SC (Kaiser et al., 1994) на основе YNB(Difco или Invitrogen) или SMC на основе раствора солей (3,5 г/л (NH4 )2 SO4 ,0,9 г/л KH2 PO4 , 0,1 г/л K2 HPO4 , 0,1 г/л MgSO4 ). Синтетические среды содержали следующие добавки: от 20 до 50 мг/л аденина, 20 мг/л L-гистидина, 60мг/л L-лейцина, 20 мг/л L-лизина, 20 мг/л L-метионина, 150 мг/л L-треонина, 20 мг/л L-триптофана, 20 мг/л урацила — а также 800 мкг/л биотина, 40мкг/л тиамина, 100 мкг/л LD-фенилаланина в случае SMC.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
