Диссертация (1145883), страница 9
Текст из файла (страница 9)
1.11, 1; Волков и др., 1997). Этот детерминант обнаружени исследован в ряде штаммов ПГЛ, родственных 2В-П3982. Два таких мутанта, несущие, как показано впоследствии, разные миссенс-мутации в гене SUP35(Volkov et al., 2002), в процессе культивирования спонтанно изменили фенотипс Ade+ His+ Lys+ на Ade± His– Lys– (рис. 1.11, 2). Пассирование таких клонов насреде с GuHCl привело к обратному изменению фенотипа, т. е.
супрессии всехэтих мутаций (рис. 1.11, 3; Волков и др., 1997).При скрещивании обработанных GuHCl клонов супрессорного фенотипаи родственного им штамма 16А-П5154 без супрессорных мутаций, т. е. с геномSUP35 дикого типа (рис. 1.11, 4), получили гибрид несупрессорного фенотипа,в мейотическом потомстве которого наблюдали ожидаемое для моногибридногоскрещивания расщепление 2:2 по супрессии. Когда же в качестве родительскогоштамма использовали 10-2В-П3982 или 25-2В-П3982, способный супрессировать только ade1-14 (рис.
1.11, 5), гибрид также обладал несупрессорным фенотипом, а в потомстве этого гибрида почти все тетрады состояли из спор, неспособных расти на среде без гистидина или лизина. Наконец, при скрещиваниисупрессорного штамма, полученного после обработки GuHCl потомков однойиз спор, полученных на предыдущем этапе работы (рис. 1.11, 6), также получили гибрид несупрессорного фенотипа, а в его мейотическом потомстве — толькотетрады, состоящие из 4 спор несупрессорного фенотипа. Таким образом, изучаемый признак (неспособность к супрессии мутаций his7-1 и lys2-87 несмотря наприсутствие мутации в гене SUP35) характеризовался доминантным неменделевским наследованием, подобно известным прионам дрожжей [PSI + ] и [URE3](Волков, 2000; Volkov et al., 2002).44(132-ду8-Л28-)2В-П398214:0Sup–:Sup+25-2В-П39822110-2В-П39822510-2В-П3982 x 16А-П515456 25-2В-П3982 x 16А-П5154xGuHClGuHClGu-21B-П44244:0 Sup–:Sup+4:0 Sup–:Sup+3344Gu-25-2В-П3982 x 16А-П5154Gu-10-2В-П3982 x 16А-П5154GuHCl2:2 Sup–:Sup+2:2 Sup–:Sup+21B-П4424Рисунок 1.11 — Результаты генетического анализа наследования фактора [ISP + ].
Объяснения в тексте. Названия штаммов без супрессорных мутаций выделены красным цветом, штаммов с супрессорными мутациями sup35-25 или sup35-10, но с фенотипом His– Lys– — сиреневым,штаммов с теми же мутациями и супрессорным фенотипом — голубым.
Четырёхлучевая звездаобозначает анализ мейотического потомства гибрида. По результатам Волков и др., 1997; Volkovet al., 2002.Этот детерминант был принят за необычную форму [PSI + ], однако в ходе дальнейшего изучения было показано, что он отличается от [PSI + ], поэтомудля него было введено новое обозначение — [TAU + ] (Волков, 2000). Несколькопозже он был переименован в [ISP+ ] (от англ. Inversion of Nonsense Suppression,инверсия нонсенс-супрессии), поскольку это название отражало сущность фенотипических изменений, связанных с этим детерминантом (Volkov et al., 2002).Следует отметить, что в митотическом потомстве обработанных пассированиемна среде с GuHCl клонов с частотой около 10-4 на клетку на поколение выщеплялись клоны несупрессорного фенотипа, т. е. происходило спонтанное возникновение клонов [ISP+ ].
Кроме того, эксперименты по цитодукции показывалипередачу детерминанта [ISP+ ] с небольшой частотой (около 17%), отличавшейся, тем не менее, от частоты его спонтанного возникновения (Volkov et al., 2002).Таким образом, два из четырёх генетических критериев, характеризующих прионы дрожжей (см. раздел 1.4.1), были выполнены, а для проверки оставшихсядвух необходимо было идентифицировать ген, кодирующий белок, который образует прион [ISP+ ].45Для поиска такого гена использовали несколько подходов, а именно:1. Поиск в генотипе штаммов [ISP+ ] мутаций, необходимых для возникновенияили поддержания [ISP+ ], с помощью трансформации этого штамма библиотекой дрожжевых генов на центромерной плазмиде (Аксенова и др., 2006;Aksenova et al., 2007);2.
Поиск генов, сверхэкспрессия которых в штамме [isp- ] приводит к появлениюклонов [ISP+ ] (Гогинашвили и др., 2009);3. Поиск генов, выключение которых в штамме [ISP+ ] приводит к невозможности поддержания детерминанта [ISP+ ] (Рогоза и др., 2009; Rogoza et al., 2010).При использовании первого подхода были получены две группы принципиально важных результатов. Во-первых, было показано, что штаммы25-25-2В-П3982 (получен из 25-2В-П3982 с помощью изменения типа спаривания) и 10-2В-П3982 содержат мутации не только в гене SUP35, но и в генеSUP45 (комбинации sup35-25 sup45-400 и sup35-10 sup45-75).
Эти мутации необладают собственным супрессорным эффектом, поскольку штаммы, содержащие любую из этих аллелей в качестве единственного источника Sup45p, небыли способны к нонсенс-супрессии. Тем не менее, наличие по крайней мереsup45-400 необходимо для формирования фенотипа [ISP+ ] в соответствующемштамме, поскольку его трансформация плазмидой с геном SUP45 дикого типаприводит к супрессии his7-1 и lys2-87 (Аксенова и др., 2006). Вопрос о том,в какой момент в геноме этих штаммов возникли мутации sup45, остаётся открытым: поскольку замены отличаются, наиболее логично предположить, что уобщего предка этих штаммов, 2В-П3982, не было ни одной из них, а его непосредственные потомки, штаммы 25-2В-П3982 и 10-2В-П3982 с супрессорнымфенотипом, не сохранились.Во-вторых, при скрининге центромерной библиотеки генов был выявленген SIS2 (HAL3), делеция которого в штамме [ISP+ ] приводила к невозможностиполучения клонов [isp- ] при обработке GuHCl, введение дополнительной копиив клоны [ISP+ ] приводило к увеличенной частоте возникновения клонов Lys+ , асверхэкспрессия — к супрессии lys2-87, по эффективности сравнимой с таковойв клонах [isp- ] (Aksenova et al., 2007).
Белок Sis2 (Hal3) обладает двойной функцией, участвуя в биосинтезе кофермента A и ингибировании фосфатазы Ppz1и Ppz2. Белки Ppz1 и Ppz2, в свою очередь, участвуют и в регуляции обмена46ионов калия, и в элонгации трансляции, взаимодействуя с фактором элонгациитрансляции eEF1Bα, осуществляющим обмен гуаниловых нуклеотидов (см. выше). Данные о том, что в штамме [isp- ] уровень Sis2p значительно выше, чем вштаммах [ISP+ ], подкрепили вывод об участии Sis2p в формировании фенотипа[ISP+ ] через ингибирование Ppz1p (Aksenova et al., 2007), однако молекулярныймеханизм, обеспечивающий повышение уровня этого белка в штаммах [isp- ],остаётся непонятным до сих пор. Следует, однако, отметить, что повышениеуровня Sis2p в штамме [isp- ] может объяснить его повышенную устойчивость кGuHCl (Аксенова, 2006), отмеченную ранее (Volkov et al., 2002).Второй подход был связан с введением в штамм [isp- ] экспрессионной библиотеки кДНК, в которой каждый ген находился под контролем промотора GAL1,индуцируемого при росте на среде с галактозой, и отбором трансформантов, нетолько приобретших несупрессорный фенотип, но и сохранивших его после прекращения сверхэкспрессии.
Этот подход позволил идентифицировать четыре гена: APD1, функция которого неизвестна, ACT1, ген актина, HSP150, кодирующийгликопротеин клеточной стенки, и RPS24A, кодирующий белок большой субъединицы рибосомы — сверхэкспрессия которых приводила к появлению клонов[ISP+ ] с более высокой частотой, чем в контроле. Для дальнейшей проверки того,может ли какой-то из этих генов являться структурным геном [ISP+ ], необходимобыло проверить, действительно ли делеция какого-либо из этих генов изменяетфенотип штамма [ISP+ ].
Для APD1 и HSP150 такие эксперименты были проделаны, однако влияния на фенотип не обнаружили. В случае генов ACT1 и RPS24Aтакой анализ был невозможен: ген ACT1 является жизненно важным, а функцию RPS24A может также выполнять почти идентичный ему ген RPS24B, в товремя как делеция обоих генов RPS24 летальна (Гогинашвили и др., 2009). Молекулярные механизмы, обеспечивающие влияние временной сверхэкспрессииэтих четырёх генов на эффективность нонсенс-супрессии, остаются не вполнепонятными.Третий подход, направленный на поиск необходимых для поддержания детерминанта [ISP+ ] генов, был основан на трансформации штамма [ISP+ ] банкомгенов, содержащих последовательности дрожжевых генов со вставкой транспозона mTn3; при трансформации с высокой вероятностью проходила гомологичная рекомбинация, приводящая к инактивации соответствующего гена. В этой47системе инактивация предполагаемого структурного гена [ISP+ ] должна былаприводить к изменению фенотипа на схожий с фенотипом штамма [isp- ].
Такойподход позволил выявить гены NAM7 (UPF1), NMD2 (UPF2) и SFP1 (Рогоза идр., 2009; Rogoza et al., 2010).Инактивация гена UFP1 или UPF2 в штамме [ISP+ ] приводила к сменефенотипа на His+ Lys+ , однако при хранении при температуре +4 °C в течениемесяца большая часть клонов приобрела фенотип His+ Lys– (Рогоза и др., 2009).Последний результат можно объяснить тем, что супрессия his7-1 при инактивации UPF1 или NMD2 связана именно с выключением пути деградации мРНКс преждевременным стоп-кодоном, субстратом которой является мРНК his7-1(Chabelskaya et al., 2007), но, по-видимому, не является мРНК lys2-87 (Рогозаи др., 2009). Вопросы о причинах временного изменения фенотипа при инактивации UPF1 или NMD2 и об идентичности процессов, происходящих в этомслучае и при пассировании на среде, содержащей GuHCl, не нашли окончательного ответа.Инактивация гена SFP1, кодирующего транскрипционный фактор, приводила к существенному снижению жизнеспособности штамма и одновременно кувеличению эффективности нонсенс-супрессии.
Важно отметить, что штаммыsfp1Δ, полученные на основе [ISP+ ] и [isp- ], не отличались по фенотипу; более того, даже после внесения центромерной плазмиды с геном SFP1 штаммыsfp1Δ сохраняли супрессорный фенотип (см. рис. 1.12), т. е. в таких штаммахвнесение SFP1 не компенсировало последствия делеции (Rogoza et al., 2010).В то же время, сверхэкспрессия гена SFP1 под контролем промотора GAL1 илис использованием мультикопийной плазмиды приводила к изменению фенотипа клонов [isp- ] на His– Lys– , причём более половины трансформантов сохранялинесупрессорный фенотип после прекращения сверхэкспрессии SFP1 (Rogoza etal., 2010).48[ISP+]Sfp1Sfp1SFP1SFP1[isp–]ДелецияSFP1SFP1SFP1ВведениеCEN-SFP1Sfp1Sfp1SFP1SFP1SFP1SFP1Рисунок 1.12 — Схема, иллюстрирующая некоторые результаты статьи Rogoza et al., 2010.Сиреневый цвет символизирует фенотип His– Lys– , голубой — фенотип His+ Lys+ .
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
