Диссертация (1145822), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Пространственная структура тримера PII-белка E.coli. (По: Forchhammer, 2008).Субъединицы тримера обозначены розовым, зеленым и синим цветами. Молекула АТФ вкомплексе с белком обозначена желтым цветом. Пунктирными линиями обозначены гибкие Тпетли.А Вид молекулы сбоку.Б Вид сверху.Цилиндрическаяпоформемолекулаобладаеттремядлиннымивыступающими наружу петлями: В, С и Т. Данные кристаллографии указываютна высокую гибкость Т-петель в растворе, благодаря чему обеспечиваютсяразличныеконформационныеизменениямолекулыибелок-белковыевзаимодействия (Forchhammer, 2008).Функционально PII-белки бактерий могут быть определены как сигнальныеинтеграторы, для которых характерно два основных способа восприятиясигналов.
Универсальный консервативный способ состоит в связыванииэффекторных молекул АТФ, АДФ и 2-ОГ (Arcondéguy et al., 2001; Forchhammer,2004; Ninfa и Jiang, 2005; Jiang и Ninfa, 2007). Три АТФ-связывающих сайта13локализованы в углублениях между соседними субъединицами и в присутствииАТФ молекула PII может связывать до трех молекул 2-ОГ на тример (Ninfa иJiang, 2005; Xu et al., 1998; Sakai et al., 2005). Было показано, что в этом случае,фосфаты от АТФ участвуют в формировании сайта связывания 2-ОГ. Три АТФсвязывающих сайта демонстрируют негативный кооперативный эффект и, к томуже, они могут конкурентно связывать АДФ. Сродство к АТФ повышается вприсутствии 2-ОГ, но не влияет на сродство к АДФ (Jiang и Ninfa, 2007).Передача сигналов через белки PII осуществляется путем прямыхвзаимодействийссоответствующимимишенями,чтоприводиткихингибированию, активированию или препятствию взаимодействий с другимибелками.
Разнообразие взаимодействий PII с мишенями весьма широко. Однако, вбольшинстве случаев, взаимодействие опосредовано высоко подвижной Т-петлей,которая имеет первостепенное значение для большинства функций PII, участвуя вформировании сайтов связывания эффекторных молекул. Связывание различныхлигандов приводит к конформационным изменениям Т-петли (Yildiz et al., 2007),что опосредует взаимодействие с белками-мишенями PII. Многообразиерегуляторных взаимодействий определяется наличием ряда вариабельныхучастковвпоследовательностиТ-петли.Физиологическоезначениеибиохимические характеристики связывания 2-ОГ белком PII описаны дляучастков молекулы, названных Box1 и Box2.
2-оксоглутарат является основой прибиосинтезе аминокислот и его уровни характеризуют углеродный статус клетки.Кроме того, на белках E. coli in vitro была показана важность связывания АДФ дляPII-рецепторных взаимодействий (Jiang и Ninfa, 2007).Другой способ восприятия сигнала молекулой белка PII (не так универсалени консервативен) – ковалентная модификация в области Т-петли. Дляпротеобактерий характерно уридилирование по остатку тирозина 51 в ответ науровни глутамина, выступающего в роли индикатора N-статуса клетки (Reitzer,2003; Ninfa и Jiang, 2005).Т.о., связывание эффекторных молекул (аллостерическая модификация) иковалентнаямодификациявобластиТ-петлиприводяткизменениям14конформационного состояния белка.
В зависимости от конформационногосостояния белок PII может связываться с различными мишенями, что приводит ких ингибированию или активации. В результате в клетке происходятадаптационныеизменениязасчетрегуляциитранспортнойактивности,активности ключевых метаболических ферментов и уровней генной экспрессии(рисунок 2).АТФВходящий сигнал:2-оксоглутаратGln НеидентифицированныесигналыКонформационные изменения белка PIIАллостерическая модификация: Связывание АТФ и 2-оксоглутаратаИнтеграция сигнала:Ковалентная модификация: Gln-зависимое уридилирование(Proteobacteria) Аденилирование (Actinobacteria) Фосфорилирование (Cyanobacteria)Выходящийсигнал:ТранспортнаяактивностьКлючевыеЭкспрессияметаболические геновферментыактивностьРисунок 2.
Регуляторная пластичность PII-белков. Пояснения в тексте. (По: Commichau et al.,2006).ПосовременныммультифункциональнымипредставленияминформационнымиявляютсяPII-белкипроцессорами,зависимости от окружения дифференциальнокоторыевпередают информацию обэнергетическом статусе и клеточных уровнях 2-ОГ и глутамина (Forchhammer иLüddecke, 2015). По-видимому, белки PII рано дивергировали от общегопредкового сигнального белка, что позволилоим приобрестибольшоеразнообразие функций на основе общей структурной организации и сходныхсенсорных способностей.15α-Протеобактерии. Большинство проанализированных α-протеобактерий,таких как р. Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium, Acetobacter, Azospirillum,Rhodobacter, Rhodospirillum, имеют по два или три гена PII.
Так, например, уAzospirillum brasiliense один ген кодирует белок, имеющий высокую степеньгомологии с GlnB, а другой – сходный с GlnK белок, тогда как в геноме R. rubrumвыявлено три гена PII-белков (GlnB, GlnK, GlnJ) (Zhang et al., 2001; Huergo et al.,2012). Как правило, ген PII-белка glnB котранскрибируется c glnA (структурныйген глутаминсинтетазы I), а glnK ассоциирован с гомологом amtB. Исключениясоставляют Azospirillum brasilense, у которого glnK-подобный ген не связан сamtB, а также Acetobacter diazotrophicus, имеющий помимо оперона glnBglnA, дваоперона glnKamtB.Представители этой филы бактерий обладают такой уникальной в природеспособностью, как фиксация атмосферного азота.
Восстановление N2 до NH3является ключевым этапом круговорота азота, который осуществляет рядпрокариотических микроорганизмов. Этот процесс катализируется нитрогеназой,наиболее распространенной формой которой является молибденовая нитрогеназа.Этот фермент состоит из гетеротетрамера динитрогеназы (MoFe-белок илиNifDK) и гомодимера редуктазы динитрогеназы (Fe-белок или NifH). Какизвестно, процесс превращения одной молекулы атмосферного азота N2 в 2молекулы NH3 является энергетически высоко затратным и требует гидролиза 16молекул АТФ. В связи с этим организмы приобрели механизмы тонкоймногоступенчатой регуляции работы нитрогеназы, функционирующие на разныхуровнях. В частности, многие диазотрофы, включая бактерий и архей,демонстрируют посттрансляционную регуляцию активности этого фермента. Упротеобактерий ферменты DraT и DraG ковалентно модифицируют белок NifH(редуктаза динитрогеназы).
АДФ-рибозилирование осуществляется белком DraT,а обратная реакция белком DraG (рисунок 3). На примере азотфиксирующих αпротеобактерий бактерий подробно изучена роль белков PII (GlnB и GlnK) иAmtB в регуляции активности DraT и DraG (Huergo et al., 2012). Когда клеткинаходятся в условиях фиксации атмосферного азота, белки GlnB и GlnK16полностью уридилированы, локализованы в цитоплазме и соответствующиесайты насыщены АТФ и 2-ОГ (на рисунке 3 обозначено +), в результате чего DraTи DraG не связаны с белками PII. В этих условиях DraT неактивен, а DraGнаходится в цитоплазме в активном состоянии.
Это приводит к активациинитрогеназы, поскольку NifH находится в нерибозилированном состоянии. Приповышении уровней аммония GlnK и GlnB деуридилируются, т.к. увеличениеуровней внутриклеточного глутамина приводит к активации деуридилазнойактивности GlnD. Снижение уровней 2-ОГ приводит к замещению АТФ на АДФ вPII-белках (на рисунке 3 обозначено *). В результате DraG секвестрируется кмембране, взаимодействуя с AmtB и GlnK, где он не может взаимодействовать сNifH, который остается в неактивной, АДФ-рибозилированной конформации. Всвою очередь DraT активируется при взаимодействии с неуридилированным,насыщенным молекулами АДФ GlnB.Рисунок 3.
Роль белков GlnK и GlnВ в регуляции активности DraT и DraG при ответе нааммоний. Пояснения в тексте. (По: Huergo et al., 2012).17Т.о.,уα-протеобактерийпоявляетсяпринципиальноинойспособнегативной регуляции с использованием белка PII, при котором PII контролируетдоступность регуляторных факторов путем формирования нерабочих комплексовили клеточной релокализации. Как оказалось, подобный механизм широкораспространенубактерийисходныепримерыPII-регуляцииуграмположительных бактерий и цианобактерий будут описаны ниже.Кроме того, в недавних исследованиях по поиску дополнительных мишенейPII у Azospirillum brasilense с использованием метода аффинной хроматографиибыл выявлен белок BCCP (biotin carboxyl carrier protein) (Rodrigues et al., 2014).Эта новая мишень, демонстрировавшая взаимодействие с белком GlnZ,представляет собой компонент ацетил-CoA карбоксилазы (ACC), котораякатализирует ключевой этап биосинтеза жирных кислот.
Кроме того, сиспользованием синтетических белков BCCP и GlnK E.coli была показанаконсервативность взаимодействия PII-BCCP у бактерий. Необходимым условиемстабильности комплекса этих белков является наличие Mg-АТФ, а 2-ОГ приводитк диссоциации комплекса PII-BCCP. Хотя в ходе этого исследования и не быловыявлено строгой зависимости от уровня уридилирования PII,однако былапоказана строгая зависимость от другой посттрансляционной модификации –биотинилирования BCCP. Только биотинилированная форма BCCP способнавыступать в качестве мишени PII. На основе особенностей структуры белка BCCPи его взаимодействия с PII авторами было выдвинуто предположение об участиибиотина в формировании сайта связывания PII. Однако в последующихисследованиях этой группы исследователей было обнаружено, что именно GlnB, ане GlnK, способен формировать тройной комплекс с белками BC-BCCP(компонентами ACCазы), в результате чего ингибируется активность ACCазы(Gerhardt et al., 2015).
Высокие концентрации 2-ОГ и уридилирование GlnBприводят к диссоциации комплекса BC-BCCP-GlnB и снятию ингибированияACCазы. Идентификация BCCP в качестве мишени PII у бактерий указывает наболее широкую роль PII, чем только регуляция метаболизма азота, и выявляет18дополнительную регуляторную связь между метаболизмом азота и углерода(Rodrigues et al., 2014; Gerhardt et al., 2015).β-Протеобактерии.Дватипичныхпредставителяβ-протеобактерий,Herbaspirillum seropedicae и Azoarcus sp., были изучены в деталях. H.seropedicaeимеет два PII-подобных гена, один из которых связан с гомологом E. сoli nadE(ген, кодирующий аммоний-зависимую НАД-синтазу) (Benelli et al., 1997).Azoarcus sp. имеет три PII-подобных гена – один гомолог glnB и два гомологаglnK, каждый из которых связан с гомологом amtB (glnK с amtB и glnY с amtY).Два гена PII, glnK и glnY, транскрибируются в основном при фиксации азота(Martin et al., 2000).Цианобактерии.
Представитель PII-белков у цианобактерий впервые былобнаружен в конце 80-х гг. у Synechococcus sp. (штамм PCC6301) при изучениифосфорилирования белков (Sanders et al., 1989). Исследователи обратиливнимание на Р32-меченный белок с молекулярной массой 12,5 кДа. Присеквенированиии N-концевой последовательности очищенного белка былавыявлена идентичность порядка 62-66% с N-концом GlnB E. coli и другихпротеобактерий(Harrisonпоследовательностей,уetal.,1990).большинстваВдальнейшем,цианобактерийбылиприанализеобнаруженыединичные гены семейства glnB, а гомолог glnK отсутствовал вовсе (Arcondéguyet al., 2001; Forchhammer, 2004).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
