Главная » Просмотр файлов » Диссертация

Диссертация (1145822)

Файл №1145822 Диссертация (Структура и функции сигнальных белков PII у одноклеточных зеленых водорослей Chlamydomonas reinhardtii и Chlorella variabilis)Диссертация (1145822)2019-06-29СтудИзба
Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла

Санкт-Петербургский Государственный УниверситетКафедра микробиологииНа правах рукописиМИНАЕВА ЕКАТЕРИНА СЕРГЕЕВНАСТРУКТУРА И ФУНКЦИИ СИГНАЛЬНЫХ БЕЛКОВ PIIУ ОДНОКЛЕТОЧНЫХ ЗЕЛЕНЫХ ВОДОРОСЛЕЙCHLAMYDOMONAS REINHARDTII И CHLORELLA VARIABILIS03.02.03 – микробиологияДиссертация на соискание ученой степеникандидата биологических наукНаучный руководитель:д.б.н., проф. Е. В. ЕрмиловаСанкт-Петербург20162СОДЕРЖАНИЕВВЕДЕНИЕ…………….….……………………………………………………………4ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………...81.1. Распространенность белков PII в природе………………………………….....81.2. PII бактерий……………………………………………………………………...91.2.1. Грамотрицательные бактерии……………………………………………..91.2.2.

Грамположительные бактерии…………………………………………...231.3. PII архей………………………………………………………………………..281.4. PII эукариот……………………………………………………………………30ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ……………………………………………...382.1. Объекты исследования и условия культивирования………………………382.2. Получение прегамет и гамет Chlamydomonas reinhardtii………………….392.3. Определение концентрации хлорофилла…………………………………...392.4. Выделение тотальной РНК…………………………………………………..402.5. Метод ПЦР, OT-ПЦР и ПЦР в режиме реального времени……………….402.6.

Клонирование и секвенирование ДНК-фрагментов……………...………..432.7. Выделение тотального белка и определение его концентрации…………442.8. Вестерн-блоттинг…………………………………………………………….442.9. Изоляция хлоропластов из клеток Chlamydomonas reinhardtii……………452.10. Определение активности глутаминсинтетазы (GS)………………………..462.11. Определение внутриклеточного содержания свободного аргинина ……..462.12.

Определение содержания глутамата в среде……………………………….472.13. Клонирование, экспрессия и очистка рекомбинантных белков…………..472.14. Гель-фильтрация……………………………………………………………..492.15. Метод оценки активности фермента NAGK……………………………….50ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ..…………………………………………...………………523.1. Характеристика белка PII Chlamydomonas reinhardtii (CrPII)……………...523.1.1. Биоинформационный анализ первичной последовательности CrPII….523.1.2.

Иммунологическая идентификация CrPII………………………………543.1.3. Транскрипция гена CrGLB1, кодирующего белок CrPII……………….5533.1.4. Олигомерная структура CrPII……………………………………………593.2. Идентификация и характеристика белка PII Chlorella variabilis (CvPII)…..603.2.1. Биоинформационный анализ первичной последовательности CvPII….603.2.2. Иммунологическая идентификация CvPII………………………………633.2.3. Определение последовательности кодирующей цепи ДНК CvPII….....643.2.4.

Транскрипция гена CvGLB1, кодирующего белок CvPII………………673.2.5. Олигомерная структура CvPII……………………………………………733.3.ХарактеристикаN-ацетил-L-глутаматкиназ(NAGK)C.reinhardtiiиC.variabilis…………………………………………………………………………..743.3.1.БиоинформационныйанализпервичныхпоследовательностейCvNAGK и CrNAGK…………………………………………………………….743.3.2. Олигомерная структура CvNAGK и CrNAGK………………………….773.4. Взаимодействие PII-белков с N-ацетил-L-глутаматкиназами……………...783.4.1. Формирование комплексов PII-NAGK…………………………………..783.4.2. Действие PII на активность NAGK………………………………………793.4.2.1. Глутамин-зависимая регуляция белками PII активности NAGKодноклеточных зеленых водорослей………………………………………...793.4.2.2. Глутамин-зависимая регуляция белками PII активности NAGKрастений……………………………………………………………………….90ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ………………………………..……....934.1.

Структура и регуляция белков PII Chlamydomonas reinhardtii и Chlorellavariabilis……………………………………………………………………………..934.2. N-ацетил-L-глутаматкиназы – мишени белков PII фотосинтезирующихорганизмов………………………………………………………………………….96ЗАКЛЮЧЕНИЕ………………………………………………………………………101ВЫВОДЫ…………………………………………………………………………….104БЛАГОДАРНОСТИ………………………………………………………………….105СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ……………………………………………….…………106СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………………...1084ВВЕДЕНИЕАктуальность темы.

Одно из фундаментальных свойств микроорганизмовсостоит в их способности быстро адаптироваться к изменениям в окружающейсреде, что обеспечивается в значительной степени эффективной работой системрецепции, передачи и интеграции экзо- и эндогенных сигналов. У прокариот(бактерий и архей) особая роль в рецепции и передаче различных по природесигналов принадлежит двухкомпонентным регуляторным системам, вовлеченнымв регуляцию метаболизма при изменяющихся условиях среды (Ермилова, 2012).Наряду с двухкомпонентными регуляторными системами ключевые функции вкоординированной регуляции центральных метаболических процессов у бактерийвыполняют сигнальные белки семейства PII (Forchhammer, 2008).

Сигналы обуровнях углерода, азота и энергетическом статусе бактериальных клетокпреобразуются в различные конформационные состояния и модификации этихбелков (Commichau et al., 2006). В зависимости от конформационного состояниябелки PII взаимодействуют с разными белками-мишенями, большинство изкоторых выполняют или регулируют ключевые реакции в путях ассимиляцииазота (Ермилова, 2012). Последние данные указывают на то, что PII-трансдукторымогут представлять одно из наиболее распространенных семейств сигнальныхбелков в природе (Sant’Anna et al., 2009). Учитывая их присутствие у архей,бактерий и высших растений, PII-белки представляют древнюю сигнальнуюсистему, которая сохранила консервативность в процессе эволюции длякоординации реакций ассимиляции азота в ответ на состояние метаболизма.Анализ структуры и функций PII-белков способствует решению фундаментальнойпроблемы биологии, связанной с выяснением механизмов, определяющих уразных по уровню организации организмов восприятие и реализацию клеткамиспецифическихответовнадействующиесигналы,включаятакиекакприсутствие/отсутствие в среде тех или иных питательных субстратов.Доначалаохарактеризованнашихниисследованийодин(Ermilovaпредставительбелковetизal.,2013)семействанебылPIIуэукариотических микроорганизмов.

Последнее обстоятельство значительно5ограничивало существовавшие представления как о свойствах самих белков, так ио спектре процессов, относящихся к метаболизму азота, которые ониконтролируют у организмов в целом.Цель работы состояла в характеристике структуры и функций сигнальныхбелков из семейства РII у модельных представителей одноклеточных зеленыхводорослей Chlamydomonas reinhardtii и Chlorella variabilis.Всвязисэтимбылисформулированыследующиезадачиисследования:1. Провести биоинформационный анализ первичных последовательностейбелков PII C. reinhardtii и C. variabilis, определить их олигомерную структуру исубклеточную локализацию.2. С помощью метода ПЦР в режиме реального времени провести анализтранскрипции генов CrGLB1 и CvGLB1 в разных условиях роста C. reinhardtii и C.variabilis.3.

Оценить возможность формирования комплексов PII-белков C. reinhardtii(CrPII) и C. variabilis (CvPII) с N-ацетил-L-глутаматкиназами (NAGK) ипроанализировать роль CrPII и CvPII в регуляции активности соответствующихNAGK.4. Провести сравнительный анализ особенностей PII-контролируемойрегуляции N-ацетил-L-глутаматкиназ C.

reinhardtii, C. variabilis и двухфилогенетически удаленных представителей высших растений – Physcomitrellapatens и Oryza sativa.Научнаяновизнаисследования.Впервыедляпредставителейфотосинтезирующих эукариотических микроорганизмов, C. reinhardtii и C.variabilis, выявлены и охарактеризованы белки из консервативного семействасигнальных белков PII.

Показано, что зрелые белки CrPII и CvPII локализованы вхлоропластах и, как белки прокариот и высших растений, формируютгомотримеры. Нерешенным вопросом эволюции PII-белков эукариот, включаяпроанализированные нами белки одноклеточных зеленых водорослей, былопоявление в их структуре удлиненного С-конца, функциональное значение6которого было неясно. Нами впервые показано, что дополнительный участок наС-конце, обозначенный нами как Q-петля, специфичен для эукариотических PIIбелков и формирует сайт для связывания глутамина.

Установлено, чтовзаимодействие с глутамином индуцирует такую конформацию PII, в которойбелок может связывать и активировать ключевой фермент метаболизма азота, Nацетил-L-глутаматкиназу, обеспечивая тем самым контрольный механизмформирования орнитина, аргинина и запасания азота в целом.Теоретическая и практическая значимость.

Нами выявлен механизмвосприятия глутамина в хлоропластах зеленых водорослей и высших растений заисключением представителей сем. Brassicaceae. Выявление первого рецептораглутамина в хлоропластах открывает дополнительные перспективы для болееглубокого понимания метаболизма азота у фотосинтезирующих организмов.Нами впервые предложен референс-ген для Chlorella variabilis, что делаетвозможным проведение корректного анализа количественной экспрессии генов уданного микроорганизма.Полученные в работе генетические конструкции могут быть использованына практике широким кругом исследователей при работе с РII-регулируемымисистемами фотосинтезирующих эукариот.Результаты, полученные в ходе выполнения проекта, могут бытьиспользованы в материалах курсов лекций, читаемых на биологическомфакультете СПбГУ («Экология микроорганизмов», «Регуляторные процессы убактерий»,«Сигнальныесистемырастений»,«Физиологиярастительнойклетки»).Основные положения, выносимые на защиту:1.

Характеристики

Тип файла PDF

PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.

Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.

Список файлов диссертации

Структура и функции сигнальных белков PII у одноклеточных зеленых водорослей Chlamydomonas reinhardtii и Chlorella variabilis
Свежие статьи
Популярно сейчас
Зачем заказывать выполнение своего задания, если оно уже было выполнено много много раз? Его можно просто купить или даже скачать бесплатно на СтудИзбе. Найдите нужный учебный материал у нас!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
6390
Авторов
на СтудИзбе
307
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее