Диссертация (1145822)
Текст из файла
Санкт-Петербургский Государственный УниверситетКафедра микробиологииНа правах рукописиМИНАЕВА ЕКАТЕРИНА СЕРГЕЕВНАСТРУКТУРА И ФУНКЦИИ СИГНАЛЬНЫХ БЕЛКОВ PIIУ ОДНОКЛЕТОЧНЫХ ЗЕЛЕНЫХ ВОДОРОСЛЕЙCHLAMYDOMONAS REINHARDTII И CHLORELLA VARIABILIS03.02.03 – микробиологияДиссертация на соискание ученой степеникандидата биологических наукНаучный руководитель:д.б.н., проф. Е. В. ЕрмиловаСанкт-Петербург20162СОДЕРЖАНИЕВВЕДЕНИЕ…………….….……………………………………………………………4ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………...81.1. Распространенность белков PII в природе………………………………….....81.2. PII бактерий……………………………………………………………………...91.2.1. Грамотрицательные бактерии……………………………………………..91.2.2.
Грамположительные бактерии…………………………………………...231.3. PII архей………………………………………………………………………..281.4. PII эукариот……………………………………………………………………30ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ……………………………………………...382.1. Объекты исследования и условия культивирования………………………382.2. Получение прегамет и гамет Chlamydomonas reinhardtii………………….392.3. Определение концентрации хлорофилла…………………………………...392.4. Выделение тотальной РНК…………………………………………………..402.5. Метод ПЦР, OT-ПЦР и ПЦР в режиме реального времени……………….402.6.
Клонирование и секвенирование ДНК-фрагментов……………...………..432.7. Выделение тотального белка и определение его концентрации…………442.8. Вестерн-блоттинг…………………………………………………………….442.9. Изоляция хлоропластов из клеток Chlamydomonas reinhardtii……………452.10. Определение активности глутаминсинтетазы (GS)………………………..462.11. Определение внутриклеточного содержания свободного аргинина ……..462.12.
Определение содержания глутамата в среде……………………………….472.13. Клонирование, экспрессия и очистка рекомбинантных белков…………..472.14. Гель-фильтрация……………………………………………………………..492.15. Метод оценки активности фермента NAGK……………………………….50ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ..…………………………………………...………………523.1. Характеристика белка PII Chlamydomonas reinhardtii (CrPII)……………...523.1.1. Биоинформационный анализ первичной последовательности CrPII….523.1.2.
Иммунологическая идентификация CrPII………………………………543.1.3. Транскрипция гена CrGLB1, кодирующего белок CrPII……………….5533.1.4. Олигомерная структура CrPII……………………………………………593.2. Идентификация и характеристика белка PII Chlorella variabilis (CvPII)…..603.2.1. Биоинформационный анализ первичной последовательности CvPII….603.2.2. Иммунологическая идентификация CvPII………………………………633.2.3. Определение последовательности кодирующей цепи ДНК CvPII….....643.2.4.
Транскрипция гена CvGLB1, кодирующего белок CvPII………………673.2.5. Олигомерная структура CvPII……………………………………………733.3.ХарактеристикаN-ацетил-L-глутаматкиназ(NAGK)C.reinhardtiiиC.variabilis…………………………………………………………………………..743.3.1.БиоинформационныйанализпервичныхпоследовательностейCvNAGK и CrNAGK…………………………………………………………….743.3.2. Олигомерная структура CvNAGK и CrNAGK………………………….773.4. Взаимодействие PII-белков с N-ацетил-L-глутаматкиназами……………...783.4.1. Формирование комплексов PII-NAGK…………………………………..783.4.2. Действие PII на активность NAGK………………………………………793.4.2.1. Глутамин-зависимая регуляция белками PII активности NAGKодноклеточных зеленых водорослей………………………………………...793.4.2.2. Глутамин-зависимая регуляция белками PII активности NAGKрастений……………………………………………………………………….90ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ………………………………..……....934.1.
Структура и регуляция белков PII Chlamydomonas reinhardtii и Chlorellavariabilis……………………………………………………………………………..934.2. N-ацетил-L-глутаматкиназы – мишени белков PII фотосинтезирующихорганизмов………………………………………………………………………….96ЗАКЛЮЧЕНИЕ………………………………………………………………………101ВЫВОДЫ…………………………………………………………………………….104БЛАГОДАРНОСТИ………………………………………………………………….105СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ……………………………………………….…………106СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………………...1084ВВЕДЕНИЕАктуальность темы.
Одно из фундаментальных свойств микроорганизмовсостоит в их способности быстро адаптироваться к изменениям в окружающейсреде, что обеспечивается в значительной степени эффективной работой системрецепции, передачи и интеграции экзо- и эндогенных сигналов. У прокариот(бактерий и архей) особая роль в рецепции и передаче различных по природесигналов принадлежит двухкомпонентным регуляторным системам, вовлеченнымв регуляцию метаболизма при изменяющихся условиях среды (Ермилова, 2012).Наряду с двухкомпонентными регуляторными системами ключевые функции вкоординированной регуляции центральных метаболических процессов у бактерийвыполняют сигнальные белки семейства PII (Forchhammer, 2008).
Сигналы обуровнях углерода, азота и энергетическом статусе бактериальных клетокпреобразуются в различные конформационные состояния и модификации этихбелков (Commichau et al., 2006). В зависимости от конформационного состояниябелки PII взаимодействуют с разными белками-мишенями, большинство изкоторых выполняют или регулируют ключевые реакции в путях ассимиляцииазота (Ермилова, 2012). Последние данные указывают на то, что PII-трансдукторымогут представлять одно из наиболее распространенных семейств сигнальныхбелков в природе (Sant’Anna et al., 2009). Учитывая их присутствие у архей,бактерий и высших растений, PII-белки представляют древнюю сигнальнуюсистему, которая сохранила консервативность в процессе эволюции длякоординации реакций ассимиляции азота в ответ на состояние метаболизма.Анализ структуры и функций PII-белков способствует решению фундаментальнойпроблемы биологии, связанной с выяснением механизмов, определяющих уразных по уровню организации организмов восприятие и реализацию клеткамиспецифическихответовнадействующиесигналы,включаятакиекакприсутствие/отсутствие в среде тех или иных питательных субстратов.Доначалаохарактеризованнашихниисследованийодин(Ermilovaпредставительбелковetизal.,2013)семействанебылPIIуэукариотических микроорганизмов.
Последнее обстоятельство значительно5ограничивало существовавшие представления как о свойствах самих белков, так ио спектре процессов, относящихся к метаболизму азота, которые ониконтролируют у организмов в целом.Цель работы состояла в характеристике структуры и функций сигнальныхбелков из семейства РII у модельных представителей одноклеточных зеленыхводорослей Chlamydomonas reinhardtii и Chlorella variabilis.Всвязисэтимбылисформулированыследующиезадачиисследования:1. Провести биоинформационный анализ первичных последовательностейбелков PII C. reinhardtii и C. variabilis, определить их олигомерную структуру исубклеточную локализацию.2. С помощью метода ПЦР в режиме реального времени провести анализтранскрипции генов CrGLB1 и CvGLB1 в разных условиях роста C. reinhardtii и C.variabilis.3.
Оценить возможность формирования комплексов PII-белков C. reinhardtii(CrPII) и C. variabilis (CvPII) с N-ацетил-L-глутаматкиназами (NAGK) ипроанализировать роль CrPII и CvPII в регуляции активности соответствующихNAGK.4. Провести сравнительный анализ особенностей PII-контролируемойрегуляции N-ацетил-L-глутаматкиназ C.
reinhardtii, C. variabilis и двухфилогенетически удаленных представителей высших растений – Physcomitrellapatens и Oryza sativa.Научнаяновизнаисследования.Впервыедляпредставителейфотосинтезирующих эукариотических микроорганизмов, C. reinhardtii и C.variabilis, выявлены и охарактеризованы белки из консервативного семействасигнальных белков PII.
Показано, что зрелые белки CrPII и CvPII локализованы вхлоропластах и, как белки прокариот и высших растений, формируютгомотримеры. Нерешенным вопросом эволюции PII-белков эукариот, включаяпроанализированные нами белки одноклеточных зеленых водорослей, былопоявление в их структуре удлиненного С-конца, функциональное значение6которого было неясно. Нами впервые показано, что дополнительный участок наС-конце, обозначенный нами как Q-петля, специфичен для эукариотических PIIбелков и формирует сайт для связывания глутамина.
Установлено, чтовзаимодействие с глутамином индуцирует такую конформацию PII, в которойбелок может связывать и активировать ключевой фермент метаболизма азота, Nацетил-L-глутаматкиназу, обеспечивая тем самым контрольный механизмформирования орнитина, аргинина и запасания азота в целом.Теоретическая и практическая значимость.
Нами выявлен механизмвосприятия глутамина в хлоропластах зеленых водорослей и высших растений заисключением представителей сем. Brassicaceae. Выявление первого рецептораглутамина в хлоропластах открывает дополнительные перспективы для болееглубокого понимания метаболизма азота у фотосинтезирующих организмов.Нами впервые предложен референс-ген для Chlorella variabilis, что делаетвозможным проведение корректного анализа количественной экспрессии генов уданного микроорганизма.Полученные в работе генетические конструкции могут быть использованына практике широким кругом исследователей при работе с РII-регулируемымисистемами фотосинтезирующих эукариот.Результаты, полученные в ходе выполнения проекта, могут бытьиспользованы в материалах курсов лекций, читаемых на биологическомфакультете СПбГУ («Экология микроорганизмов», «Регуляторные процессы убактерий»,«Сигнальныесистемырастений»,«Физиологиярастительнойклетки»).Основные положения, выносимые на защиту:1.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
