Диссертация (1145822), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Дляэкспрессии белка СvPII в клетках E.coli была использована последовательностьгена СvGLB1 (Minaeva и Ermilova, 2015), соответствующая зрелому белку PII безтранзитного пептида хлоропластной локализации (начиная с 48 аминокислоты).ПоследовательностиДНКбылиполученыизаминокислотныхпоследовательностей зрелых, локализованных в хлоропластах, белков OsPII(BAF16476.1) и PpPII (BAF36548.1), начиная с аминокислот 69 и 60,соответственно.
Синтетический ген CvPII был амплифицирован с использованиемпарыпраймеров5-GAAATGAATAGTTCGACAAAAATCTAGATAACGAGGGCAAAAAATGTGCAACTCGGGCAGCAACGG-3 и 5-AGCTTATTATTTTTCGAACTGCGGGTGGCTCCAAGCGCTGAGCACCCCCTTGATCCCAGTCATG-3.48Синтетический ген OsPII был амплифицирован с использованием пары праймеров5'-AATAGTTCGACAAAAATCTAGATAACGAGGGCAAAAAATGGCCCAATCTGCAGCCGCTGС-3' и 5'-AAGCTTATTATTTTTCGAACTGCGGGTGGCTCCAAGCGCTACTAATTGGCATAGCACTGC-3'.амплифицировансиспользованиемСинтетическийпраймеровгенбылPpPII5'-AATAGTTCGACAAAAATCTAGATAACGAGGGCAAAAAATGGTTGCCTCTGCGAGCGATCС-3 'и 5'AAGCTTATTATTTTTCGAACTGCGGGTGGCTCCAAGCGCTGTTCCCATCTGAGCCTTCCGC-3’.
ПЦР продукты были клонированы в вектор pASK-IBA3plus(IBA GmbH, Германия), разрезанный по сайтам рестрикции NcoI и SacII, сиспользованиемизотермальногометодасборкимножественныхпоследовательностей по Гибсону (Gibson et al., 2009). Полученные конструкцииPII-белков трансформировали в клетки E.coli штамм RB9060 с делецией по PIIбелку(Buenoetal.,Индуцировали1985).экспрессиюPII-белковсострептавидиновым тагом из восьми аминокислот (TrpSerHisProGlnPheGluLys) наС-конце (Strep-tagII) добавлением 0,2 мМ ангидротетрациклина к суспензииклеток E.coli с оптической плотностью 0,5 единиц в течение ночи при постоянномпокачивании (200 об/мин, 20°С).
Очистку рекомбинантных PII-белков сострептавидиновымитагамибезпоследовательностейсоответствующихтранзитных пептидов (StrepCrPII-tp, StrepCvPII-tp, StrepPpPII-tp, StrepOsPII-tp) доблизкой электрофоретической гомогенности проводили с использованием методааффинной хроматографии на колонке с иммобилизованной Strep-tactin агарозой(IBA GmbH, Геттинген, Германия) как это было описано ранее (Heinrich et al.2004).Рекомбинантный белок NAGK одноклеточной зеленой водоросли ChlorellavariabilisбылполученоптимизированнымснаборомиспользованиемкодоновдлясинтетическогоэкспрессиигенавсE.coli(Geneart/LifeTechnologies, Германия). Последовательность ДНК CvNAGK былаполучена на основе аминокислотной последовательности зрелого белка,локализованного в хлоропласте, начиная с аминокислоты 48. Синтетический генCvNAGKбыламплифицировансиспользованиемпарыпраймеров5-49ATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCGCGCCGCAAGCCTCCAAGGC-3и5-TTCCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCCTCGAGCATATGTTATAGGGGCCGCTCACATATC-3.
ПЦР продукт был клонирован ввектор pET15b (Novagen, Германия) по сайту рестрикции NdeI с использованиемстратегии клонирования по Гибсону (Gibson et al., 2009). ПолученнуюконструкциюCvNAGK,соответствующуюпоследовательностибелкабезтранзитного пептида с тагом из шести гистидинов на N-конце (His6CvNAGK-tp),трансформировали в клетки E.coli штамм Rosetta (Novagen, Германия).Индуцировали экспрессию добавлением 0,1 М IPTG к суспензии клеток E. coli соптической плотностью 0,5 единиц в течение ночи при постоянном покачивании(200 об/мин, 20°С). Очистку CvNAGK до близкой электрофоретическойгомогенности проводили с использованием метода аффинной хроматографии наколонке с иммобилизованной Ni-NTA агарозой (IBA GmbH, Германия) как этобыло описано ранее (Maheswaran et al., 2004).Рекомбинантный белок AtNAGK с шестью гистидинами на N-конце безпоследовательности транзитного пептида (His6AtNAGK-tp) был экспрессирован иочищен как описано ранее (Beez et al., 2009).2.14.
Гель-фильтрацияДля определения олигомерного состояния белков PII и NAGK, а такжеанализа характера их взаимодействия был использован метод эксклюзионнойхроматографии (гель-фильтрации). Аликвоты белков (10 мкл с концентрацией 1-3мкг/мкл) центрифугировали при 14000 об/минв течение 3 мин, а затемхроматографировали на колонке Superdex 200 10/300 GL (Amersham Biosciences,Германия) с использованием системы AKTA micro (GE Healthcare LifeSciences,Германия) при комнатной температуре. Предварительно колонку уравновешивалирабочим буфером следующего состава: 10 мМ Трис рН 7,8, 300 мМ NaCl, 1 мМДТТ, 2 мМ MgCl2, 20 мкМ Arg, 0,02% NaN3, и 2% глицерина. Скорость потокасоставляла 0.05 мл/мин. Профиль элюции белка (или смеси белков) фиксировался50с помощью УФ-детекциипри длине волны 280 нм и анализировался с помощьюпрограммного обеспечения UniCorn5 (GE Healthcare LifeSciences, Германия).Колонка Superdex 200 10/300 GL калибровалась с использованиемстандартныхнаборовбелковсизвестнымимолекулярнымимассами:тироглобулин (670 кДа), альдолаза (158 кДа), кональбумин (75 кДа), овальбумин(44 кДа), карбоангидраза (29 кДа), миоглобин (17.5 кДа), рибонуклеаза A (13.7кДа) и апротинин (6.5 kDa).Для анализа действия молекул-эффекторов на формирование комплексаCvPII-CvNAGK использовался метод кросс-линкинга с глутаровым альдегидом.Белки PII (1 мкг/мкл) и NAGK (1.5 мкг/мкл) в PBS-Mg буфере подвергалисьдействиюглутаровогоальдегида(0.1%)втечение3минпри37°С,центрифугировали (14000 об/мин, 3 мин) и хроматографировали как описановыше.
Смесь белков PII-NAGK инкубировалась с эффекторными молекулами(Gln, 2-ОГ, ATФ) в течение 5 минут до реакции кросс-линкинга.2.15. Метод оценки активности фермента NAGKАктивность очищенных рекомбинантных белков NAGK была измерена всопряженных ферментативных реакциях: ATФ-зависимое фосфорилированиеNAG через пируваткиназу и лактатдегидрогеназу с последующим окислениемНАДН (Beez et al., 2009). Реакционная смесь содержала 50 мМ имидазола рН 7.5,50 мМ KCl, 20 мМ MgCl2, 0,4 мМ НАДН, 1 мМ фосфоенолпирувата, 10 мМ АТФ,0,5 мМ ДТТ, 11 U лактатдегидрогеназы, 15 U пируваткиназы и 50 мМ NAG.
Принеобходимости в реакционную смесь добавляли 2,4 мкг белка PII и реакциюзапускали добавлением 3 мкг NAGK, если не указано иное. Реакцияфиксировалась в течение 10 мин с использованием спектрофотометра SPECORD200 (Analytik Jena, Германия) при 340 нм. Фосфорилирование одной молекулыNAG пропорционально окислению одной молекулы НАДН, что регистрируетсякак линейное уменьшение оптической плотности при длине волны 340 нм. Однаединица NAGK катализирует превращение 1 мкмоль NAG в минуту срассчитанным с молярным коэффициентом поглощения НАДН ( 340 = 6178 L51моль-1 см-1).
Средние значения трех экспериментальных определений былиприведены со стандартным отклонением <5%. Энзиматические параметры Км,Kcat, Hillslope и IC 50 рассчитывали исходя из наклона кривой скорости реакции,используя программное обеспечение GraphPad Prism-6.01 (GraphPad Software,США).52ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ3.1. Характеристика белка PII Chlamydomonas reinhardtii (CrPII)3.1.1. Биоинформационный анализ первичной последовательности CrPIIВ геноме Chlamydomonas reinhardtii была выявлена полипептиднаяпоследовательность предполагаемого белка PII, закодированная геномGLB1.Длина этого белка составляет 205 аминокислот, а его молекулярная масса 22070,40дальтон.Увсехпроанализированныхнасегодняшнийденьцианобактерий и высших растений в геномах содержатся только GlnB-гомологиPII, функции которых значительно отличаются от таковых у архей игетеротрофных бактерий (см.
гл. 1). Был проведен сравнительный анализаминокислотной последовательности белка PII C. reinhardtii с первичнымипоследовательностямисоответствующихбелковвысшихрастенийицианобактерий (рисунок 10).ICrAtOsSlSyScEc57566153111CrAtOsSlSyScEc137132141129585858RRAPYAELESIQCDLSAFPGVKFFRIEAIFRPWRLPFVIDTLSKYGIRGLTNTPVKGVGVQGGSRERYAGTEFGPSNLVD----VLPVVSAQISSDYIPDSKFYKVEAIVRPWRIQQVSSALLKIGIRGVTVSDVRGFGAQGGSTERHGGSEFSEDKFVARLPPTAARAQSAAAAGYQPESEFYKVEAILRPWRVPYVSSGLLQMGIRGVTVSDVRGFGAQGGSTERHEGSEFAEDTFID----SFPIIRAQNSPDFVPDAKFYKVEAILRPWRIQQVSSALLKMGIRGVTVSDVRGFGAQGGLTERQAGSEFSEDTFVA----------------------MKKIEAIIRPFKLDEVKIALVNAGIVGMTVSEVRGFGRQKGQTERYRGSEYTVE-FLQ----------------------MKKVEAIIRPFKLDEVKIALVNAGIVGMTVSEVRGFGRQKGQTERYRGSEYTVE-FLQ----------------------MKKIDAIIKPFKLDDVREALAEVGITGMTVTEVKGFGRQKGHTELYRGAEYMVD-FLPIIT-loopKEKLDIVVSRAQVDAVVRLVAASAYTGEIGDGKIFVHPVAEVVRIRTAETGLEAEKMEGGMEDMMKKKK--KVKMEIVVKKDQVESVINTIIEGARTGEIGDGKIFVLPVSDVIRVRTGERGEKAEKMTGDMLSPS------KVKMEIVVSKDQVEAVVDKIIEKARTGEIGDGKIFLIPVSDVIRIRTGERGERAERMAGGLADKLSSAMPISKVKMEIVVSKDQVEGVIAKIIEEARTGEIGDGKIFLTPISDVIRVRTGERGEKAERMMGGHADMSSALSTSKLKLEIVVEDAQVDTVIDKIVAAARTGEIGDGKIFVSPVDQTIRIRTGEKNADAI----------------KLKIEIVVDEGQVDMVVDKLVSAARTGEIGDGKIFISPVDSVVRIRTGEKDTEAI----------------KVKIEIVVPDDIVDTCVDTIIRTAQTGKIGDGKIFVFDVARVIRIRTGEEDDAAI-----------------Рисунок 10.
Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей PII-белковC.reinhardtii, растений и бактерий. Chlamydomonas reinhardtii (Cr; XP_001703658.1), Arabidopsisthaliana (At; NP_192099.1), Oryza sativa Japonica (Os; NP_001054562.1), Solanum lycopersicum(Sl; AAR14689.1), Synechococcus PCC 7942 (Sy; P0A3F4.1), Synechocystis sp. PCC 6803 (Sc;CAA66127.1), E. coli (Ec; AP_003139.1).
Выделенные черным остатки консервативны у 60%анализируемых PII-белков. Блоки I и II обозначают две консервативные последовательностисубсемейства GlnB, PS00496 и PS00638. Белыми и черными стрелками обозначены позициитирозиновых оснований, подвергающихся уридилированию в белке PII E. coli, и сериновыхоснований, фосфорилируемых у Synechoccocus PCC 7942, соответственно. АТФ-связывающиеоснования отмечены черными кружками. Выравнивание последовательностей проводилось спомощью программного обеспечения ClustalW.53ОбластьгомологиипоследовательностьпрокариотическимбактериальногобелкамбелкаPIIивключаетнаходитсяполнуюмеждуаминокислотами 82 и 183 белка PII C. reinhardtii (CrPII). Общая идентичностьпоследовательностей в этой области белков CrPII и PII E.
coli составляет 48,5%.Крометого,высокаястепеньсходствавпределахэтогорегиона,соответствующего PII E. coli, также была выявлена для последовательностей glnBгенов высших растений и цианобактерий, таких как Arabidopsis thaliana (53,5 %),Oryza sativa Japonica (40,3 %), Solanum lycopersicum (39,0 %), Synechococcus PCC7942 (53,5 %), Synechocystis sp. PCC 6803 (52,0 %).
Помимо высокого процентаидентичности всей аминокислотной последовательности между различными PIIбелками цианобактерий, растений и C. reinhardtii, были выявлены двахарактерных паттерна PROSITE с особо высоким сходством последовательностей(PS00496 и PS00638).У многих бактерий, как уже отмечалось в гл. 1, PII-белки регулируютсяпутем ковалентной модификации по консервативным основаниям. Так, например,упротеобактерийPIIподвергаетсяобратимомууридилированиюпоспецифическому основанию тирозинана Т-петли в положении 51 (Tyr-51), тогдакак у некоторых цианобактерий этот белок может быть фосфорилирован посериновому основанию (Ser-49), локализованному на расстоянии двух основанийот Tyr-51 протеобактерий (Forchhammer и Tadeau de Marsac, 1994).
Несмотря нато, что PII-белки растений остаются консервативными по наличию основания Ser49, они не подвергаются модификации путем фосфорилирования (Smith et al.,2004). У C. reinhardtii соответствующая позиция занята треонином, который тожене исключает возможности фосфорилирования. Однако было показано, что белокPII C. reinhardtii также не фосфорилируется (Ermilova et al., 2013).Стоит отметить, что консервативная последовательность В-петли в белкеСrPII содержит все необходимые основания для связывания АТФ между двумясоседними субъединицами тримерного белка PII.В белках PII растений было выявлено наличие неконсервативных N- и Сконцевых участков, отсутствующих у прокариотических белков PII (Uhrig et al.,542009). Как и у высших растений, в состав неконсервативного N-концевого участкаCrPIIвходитпоследовательностьсигнальногопептида,определяющегохлоропластную локализацию (аминокислотные остатки с 1 по 46) (ChloroP Centerfor Biological Sequence Analysis, Emanuelsson et al., 1999; Emanuelsson et al., 2007).Этот предварительный анализ указывает на то, что как и его гомологи у высшихрастений, PII C.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
