Диссертация (1145822), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Анализ олигомерной структуры белка CvPII методом эксклюзионнойхроматографии (гель-фильтрации). mAU – уровень сигнала УФ-детектора при длине волны 280нм; Ve/Vo – объем элюции.А Стандартная калибровочная кривая по белкам с известными молекулярными массами.Б Профиль элюции CvPII.3.3. Характеристика N-ацетил-L-глутаматкиназ (NAGK)C. reinhardtii и C.
variabilis3.3.1. Биоинформационный анализ первичных последовательностейCvNAGK и CrNAGKВ последовательностях CrPII и CvPII были выявлены консервативныеостатки,которыеуцианобактерийивысшихрастенийотвечаютзавзаимодействие PII с N-ацетил-L-глутаматкиназой (NAGK). Как уже упоминалось,NAGK является ключевым ферментом биосинтеза аргинина (см. гл. 1), активностькоторого у цианобактерий и высших растений контролируется PII.
Ранеесообщалось, что ключевыми основаниями в последовательности NAGK S.elongatus для взаимодействия с PII являются Glu194, Arg233, Arg254, Ala257 иGln258,которыеконсервативныиуникальнысредиоксигенных75фотосинтезирующихорганизмов,включаяC.reinhardtiiиС.variabilis(Chellamuthu et al., 2013).
Более того, утеря этих оснований в последовательностяхNAGK двух красных водорослей (Gracilaria tenuistipitata и Cyanidioschyzonmerolae) коррелирует с отсутствием PII белков у этих организмов (Llacer et al.,2007; Chellamuthu et al., 2013). Кроме того, отмечалась высокая степеньконсервативности и уникальность цистеиновой пары Cys-Сys на С-конце NAGKоксигенных фотосинтезирующих организмов, в том числе одноклеточныхзеленых водорослей, расположенной между основаниями Arg233 и Ala257последовательности SeNAGK. Несмотря на то, что эта цистеиновая пара непринимает непосредственного участия в формировании комплекса PII-NAGK,было предположено наличие пока не идентифицированного редокс-зависимогомеханизма контроля синтеза аргинина при смене условий свет/темнотауцианобактерий и растений (Chelamuthu et al., 2013).В геномах C.
reinhardtii и C. variabilis были выявлены гены белковCrNAGK1(EDP09199.1)иCvNAGK(EFN52177.1),кодирующиесоответствующие ферменты. Белок CrNAGK состоит из 340 аминокислотныхостатков с молекулярной массой 35,97 кДа, а белок CvNAGK состоит из 343аминокислот и с молекулярной массой 36,23 кДа. У эукариотическихфотосинтезирующих организмов гены, кодирующие эти белки, находятся в ядре,а продукты имеют хлоропластную локализацию. С помощью программногообеспечения ChloroP и TargetP удалось идентифицировать сигнальные пептиды вбелках CrNAGK и CvNAGK, которые предполагают их локализацию вхлоропластах.ДлинатранзитнотногопептидаCrNAGKсоставляет42аминокислоты, а молекулярная масса зрелого белка 31,47 кДа.
В свою очередьдлинатранзитнногопептидаCvNAGKсоставляет47аминокислот,амолекулярная масса зрелого белка 33,4 кДа.Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей показал, чтоNAGK C. reinhardtii и C. variabilis демонстрируют достаточно высокий процентидентичности с последовательностями NAGK A. thaliana (55,25% для C.76reinhardtii и 52,37% для C. variabilis) и S. elongates (57,47% и 61.67%,соответственно) (рисунок 24).Также в обоих белках зеленых водорослей были выявлены консервативныедомены белков NAGK, которые у E.
coli участвуют в связывании NAG и ATP.Рисунок 24. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей NAGK C.reinhardtii, C. variabilis с соответствующими последовательностями бактерий и высшихрастений. Chlamydomonas reinhardtii (Cr; EDP09199.1), Chlorella variabilis (Cv; EFN52177.1),Arabidopsis thaliana (At; AEE79672.1), Oryza sativa Japonica (Os; BAD25688.1), Solanumlycopersicum (Sl; NP_001306260.1), Synechococcus elongatus PCC 6301 (Se; BAD80672.1),Synechocystis sp. PCC 6803 (Sy; ALJ67082.1), E. сoli (Ec; EDV66610.1). Выделенные чернымостатки консервативны у 60% анализируемых NAGK-белков. Основания, участвующие вобразованиикомплексасPIIотмеченычернымикружками.Выравниваниепоследовательностей проводилось с помощью программного обеспечения ClustalW.773.3.2.
Олигомерная структура CvNAGK и CrNAGKБелки NAGK у всех ранее изученных организмов представляют собойгексамеры. Поскольку при анализе аминокислотных последовательностейCrNAGK и CvNAGK была выявлена высокая степень идентичности, естьоснования предполагать значительную степень сходства структуры и функцииэтих белков.Дляэкспериментальногодоказательствагексамернойструктурырекомбинантный белок CvNAGK с N-концевым полигистидиновым тагом былсинтезирован в E. coli штамм Rosetta (Novagen).
Расчетная молекулярная массаэтого рекомбинантного белка составляет 33396,51 Да. Анализ очищенного доэлектрофоретической гомогенности рекомбинантного белка CvNAGK методомгель-фильтрации показал, что CvNAGK элюирует в виде единственного пика,соответствующего гексамерной форме фермента (рисунок 25). Для сравнения,олигомерное состояние C.
reinhardtii NAGK (CrNAGK) было гетерогенным поразмеру (рисунок 25, инсерция; Chellamuthu et al., 2014), указывая на то, чтогексамерное состояние NAGK C. variabilis является более стабильным, чем у C.reinhardtii.Рисунок 25. Анализ олигомерной структуры белка CvNAGK методом эксклюзионнойхроматографии (гель-фильтрации).А Стандартная калибровочная кривая по белкам с известными молекулярными массами.Б Профиль элюции CvNAGK.
Инсерция – профиль элюции CrNAGK.783.4. Взаимодействие PII-белков с N-ацетил-L-глутаматкиназами3.4.1. Формирование комплексов PII-NAGKКак было отмечено выше, в последовательностях CrPII и CvPII выявленыконсервативные остатки, которые у цианобактерий и высших растений отвечаютза взаимодействие PII с N-ацетил-L-глутаматкиназой (NAGK) (рисунок 16),которая является ключевым ферментом биосинтеза аргинина. Активность NAGKу цианобактерий и высших растений контролируется PII. Ранее были полученыкристаллические структуры PII-NAGK S. elongatus (Llacer et al., 2007) и A.thaliana (Mizuno et al., 2007б), согласно которым три димера NAGK образуютгексамерный тороид с двумя идентичными поверхностями, взаимодействующимис двумя тримерами PII (рисунок 4). В работе коллег было показано, чтосигнальный белок PII C. reinhardtii активирует NAGK по глутамин-зависимомупринципу (Chellamuthu et al., 2014).
Методом эксклюзионной хроматографии былпроанализирован процесс формирования комплексов между CvPII и CvNAGK(рисунок 26). В отсутствии эффекторных молекул, несмотря на образованиекомплекса CvPII-CvNAGK, также присутствуют высокомолекулярные агрегаты,что может указывать на нарушение конформации белков при образованиикомплекса.Кроме того,дажевприсутствииMg-АТФнепроисходитэффективного образования комплексов с четким пиком элюции. Однако придобавлении к смеси 15 мМ глутамина элюируемая фракция, соответствующая поразмеру комплексу из двух тримеров CvPII и одного гексамера CvNAGK,значительноувеличилась,чтосопровождалосьснижениемколичествавысокомолекулярных олигомеров.Полученные результаты хорошо согласуются с литературными данными,согласно которым одна молекула NAGK взаимодействует с двумя молекуламиPII.
Интересно, что в присутствии 2-ОГ профиль элюции не изменялся иидентифицировался единственный пик с молекулярной массой близкой к 265 кДа(рисунок 26). Таким образом, 2-ОГ не оказывает ингибирующего действия на79образование комплекса NAGK-PII. Сходное действие 2-ОГ было описано и длякомплекса CrPII-CrNAGK (Chellamuthu et al., 2014).Рисунок 26.
Анализ формирования комплекса CvPII-CvNAGK методом гель-фильтрации.Молекулы-эффекторы добавлялись в смесь белков до реакции кросс-линкинга. Глутаминзависимое взаимодействие CvPII с CvNAGK показано при 15 мМ глутамина и 2 мМ Mg-АТФ(черная сплошная линия). Влияние 2-ОГ на формирование комплекса показано приконцентрации 0.5 мМ 2-ОГ (серая пунктирная линия).3.4.2. Действие PII на активность NAGK3.4.2.1. Глутамин-зависимая регуляция белками PII активности NAGKодноклеточных зеленых водорослейХарактеристика ферментативной активности CvNAGK.
Характеристикакаталитической активности фермента NAGK определялась с использованиемописанного ранее метода сопряженных ферментных реакций (Beez et al., 2009).Были определеныкинетические константы очищенного рекомбинантногофермента CvNAGK, который демонстрировал значения Km для NAG 1,5 ± 0,12мM и максимальное значение Kcat 35,35 ± 1,04 с-1 (рисунок 27). Значение Kmблизко полученному ранее Km Arabidopsis thaliana AtNAGK (Km (NAG) 0,87 ±0,11 мм), но в 5 раз ниже, чем у цианобактерий Synechococcus elongatus SeNAGK(Km (NAG)в7,4мМ).Примечательно,чтозначениеKcatявляется80промежуточным между значениями, зафиксированными для AtNAGK (126 с-1) иSeNAGK (13 с-1) (Beez et al., 2009).
Значения обоих кинетических параметров дляCrNAGK несколько выше, чем у Chlorella (Km (NAG) 7,7 мМ и Kcat 56,76 с-1), чтоуказывает на более высокую скорость протекания реакции, но меньшуючувствительность к субстрату у белка Chlamydomonas (Chellamuthu et al., 2014).Следует отметить, что добавление PII в реакционную смесь лишь незначительноотражалось на кинетических параметрах CvNAGK.Рисунок 27. Активность CvNAGK в зависимости от концентрации субстрата NAG вприсутствии и отсутствии PII.Ингибирование аргинином активности NAGK представляет собой ключевойрегуляторный механизм, контролирующий биосинтез аргинина.
В связи с этим,были проведены исследования эффекта ингибирования CvNAGK аргинином.Значение половины максимальной ингибирующей концентрации аргинина (IC50)составило 1,2 ± 0,05 мМ (рисунок 28), что близко к значению, определенному дляAtNAGK (1 мМ). Однако было показано, что значительно более высокиеконцентрации аргинина были необходимы для ингибирования CvNAGK посравнению с CrNAGK (IC50 0.11 мМ).81Рисунок 28. Ингибирование аргинином активности CvNAGK.А Ингибирующее действие аргинина на активность CvNAGK в отсутствии и присутствии CvPIIс 15 мМ глутамина.Б Ингибирующее действие аргинина на активность CvNAGK (в процентах).Ранее было показано, что белок PII способен ослаблять ингибирующеедействие аргинина на NAGK (Beez et al., 2009).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
