Диссертация (1145822), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Как и ожидалось, уровни аргинина в клетках С.variabilis, выращенных на среде с 2 мМ глутамина, примерно в 2 раза ниже, чем вклетках, выращенных на среде с 10 мМ глутамина. Примечательно, что клетки,выращенные на среде с 10 мМ глутамина, демонстрируют приблизительнотрехкратное увеличение пула аргинина по сравнению с клетками, выращеннымина MBBM с бактопептоном в качестве источника азота (рисунок 33).
Такимобразом, экзогенный глутамин, содержащийся в среде, приводит к повышениюуровней внутриклеточного аргинина.ДействиеглутаминанаактивностьиэкспрессиюGS.Чтобыдополнительно подтвердить, что экзогенный глутамин способен оказыватьвлияние на биосинтетические реакции в NC64A, общая активность GS такжеопределялась при разных условиях роста (рисунок 33Б). В среде MBBMактивность фермента в клетках в поздней экспоненциальной и в стационарнойфазах роста была выше, чем в клетках на ранней экспоненциальной фазе (рисунок33Б). Примечательно, что в среде с 10 мМ глутамина активность GS былазначительно снижена по сравнению со средой MBBM. Более того, значения былидаже ниже, чем в начале экспоненциальной фазы в среде MBBM.
Активность GSтакже поддерживалась на низком уровне при росте на 2 мМ глутамина. Судя повсему, активность GS негативно регулируется внешним глутамином, указывая нато, что внешний глутамин влияет на внутриклеточный метаболизм азота. Этиданные хорошо согласуются с тем, что было показано для многих бактерий, гдеGS отрицательно регулируется в условиях избытка глутамина.88Чтобы определить, происходит ли репрессия активности GS на уровнетранскрипцииилипосттранскрипционно,былпроведенпоискпоследовательностей генов по базам данных C.
variabilis NC64A. Два выявленныхкандидата для обеих изоформ GS были обозначены как CvGS1 (EFN58800.1) иCvGS2 (EFN56917.1). Поскольку экспрессия гена GS1 у С. reinhardtii подавляетсяаммонием(Chen и Silflow, 1996), мы сначала проанализировали действиеаммония на экспрессию генов CvGS (рисунок 34).После перенесения клеток NC64A, выращенных на MBBM, на среду с 25мМ аммония уровни транскриптов CvGS1 и CvGS2 оставались практическинеизменными (рисунок 34АБ). Уровень транскрипта CvGS1 увеличивался в 5,7 и3,2 раза, когда клетки инкубировали с метионин-DL-сульфоксимином (MSX),специфическим ингибитором глутаминсинтетазы, в течение4 ч и 24 ч,соответственно.
Тем не менее, не было выявлено заметного влияния MSX науровень мРНК CvGS1 после 1 ч инкубации (рисунок 34A). Неизменный уровеньэкспрессии CvGS1 после 1 ч инкубации с MSX согласуется с данными,демонстрирующими полное ингибирование общей активности GS только после 2ч с момента добавления MSX (данные не приведены). Интересно, что уровнитранскриптов CvGS2 также сильно возрастают в течение 4 ч и 24 ч последобавления MSX (рисунок 34Б). Наблюдаемое увеличение экспрессии CvGS1иCvGS2 в среде с аммонием в присутствии MSX предполагает, что глутамин илиего производные участвуют в репрессии обоих генов CvGS.Кроме того, было выявлено, что уровни обоих транскриптов максимальновозрастают через 4 ч голодания по азоту (рисунок 34В).
Уровни транскриптовCvGS1 и CvGS2 были значительно выше в среде без азота, чем в среде,содержащейглутамин,демонстрируянегативноевлияниеглутаминанаэкспрессию этих генов. Кроме того, можно сделать вывод, что обе формыглутаминсинтетазы С. variabilis не находятся под непосредственным контролемвнутриклеточного аммония, так как уровни их транскриптов не возрастали в средебез аммония.89Рисунок 34. Анализ уровней экпрессии генов CvGS методом ПЦР в режиме реального временипри выращивании на средах с разными источниками азота и среде без азота.А Относительные уровни транскрипции CvGS1.
Клетки Chlorella были выращены на МВВМ иперенесены на с среду с аммонием в присутствии и отсутствии 2 мМ MSX или на среду сглутамином на 1 ч, 4 ч и 24 ч. Ген ACT1 был использован в качестве нормализатора.Б Относительные уровни транскрипции CvGS1. Клетки Chlorella были выращены как описано впункте А.В Относительные уровни транскрипции генов CvGS на среде без источника азота.
КлеткиChlorella были выращены на среде МВВМ и перенесены на среду без азота на 2 ч и 24 ч.903.4.2.2. Глутамин-зависимая регуляция белками PIIактивности NAGK растенийДо недавнего времени единственным эукариотическим организмом, длякоторого детально был изучен эффект PII на активность ингибированногоаргинином NAGK, оставался A. thaliana (представитель семейства Brassicaceae).В связи с тем, что на одноклеточных зеленых водорослях Chlamydomonas иChlorella впервые был обнаружен описанный выше феномен опосредованногоглутаминомPII-сигналинга,возниквопрособуникальностииликонсервативности данного явления.
Поскольку данные кристаллографии белка C.reinhardtii указывали на то, что в связывании глутамина участвуют аминокислотына С-конце PII (этот участок белка был назван Q-петлей), был проведенсравнительный анализ последовательностей растительных белков PII (рисунок35), который показал, что остатки Q-петли являются частью консервативногомотиванаС-конце,иприсутствуютвовсехпроанализированныхпоследовательностях, за исключением сем. Brassicaceae, к которому принадлежитА. thaliana.91Рисунок 35. Выравнивание аминокислотных последовательностей С-конца белков PII растенийи цианобактерий. Аминокислотные основания консервативного мотива Q-петли, участвующиев формировании сайта связывания глутамина, выделены желтым цветом; замена оснований R/Kв этом мотиве выделена зеленым цветом.Q-петля у членов сем.
Brassicaceae содержит делецию в три аминокислоты,с чем может быть связана глутамин-независимая конформация Q-петли. В связи сэтим было сделано предположение, что глутаминовый сигналинг может бытьобщей функциональной чертой PII растений, а представители сем. Brassicaceaeявляются лишь исключением. Для проверки этого предположения были полученырекомбинантные белки PII для двух филогенетически удаленных растений – мхаPhyscomitrella patens и риса Oryza sativa. Чтобы проанализировать эффектглутамина, эти PII-белки были добавлены к AtNAGK, ингибированномуаргинином, при возрастающей концентрации глутамина.
Анализ ферментативнойактивности NAGK показал, что оба белка PII были способны повышать92активность ингибированного аргинином AtNAGK по глутамин-зависимомумеханизму: PII Physcomitrella с ЕС50 6,6 мМ, а PII Oryza с ЕС50 9,2 мМ (рисунок36). Эти данные подтверждаютто, что выявленный у зеленых водорослейглутамин-зависимый ответ является общим свойством PII-белков растений, апредставители сем.
Brassicaceae составляют лишь исключение.Рисунок 36. Зависимость от глутамина способности белков AtPII, OsPII, PpPII активироватьингибированный аргинином AtNAGK.93ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ4.1. Структура и регуляция белков PIIChlamydomonas reinhardtii и Chlorella variabilisPII-белки цианобактерий и растений принадлежат к субсемейству GlnB. Вгеномах одноклеточных зеленых водорослей Chlamydomonas reinhardtii иChlorella variabilis идентифицированы единичные гены, кодирующие GlnBгомологи. Первичная последовательность белков CrPII и CvPII имеет высокийпроцент идентичности с первичными последовательностями соответствующихбелков других оксигенных фотосинтезирующих организмов (цианобактерий ирастений) и содержит консервативные консенсусные участки, соответствующиеB, C и Т-петлям (рисунок 16).
Кроме того, сохраняются все необходимые сайтыдля связывания таких эффекторных молекул как АТФ и 2-ОГ, что предполагаетспособность этих белков функционировать в зависимости от энергетическогостатуса клетки и соотношения уровней N/C.Как отмечалось ранее (см. гл. 1), примечательной особенностью PII-белковфотосинтезирующих эукариот, включая С.
reinhrdtii и C.variabilis, являетсяналичие удлиненных участков на N- и С-концах молекулы. Несмотря на то, чтобелок РII у растений (A. thaliana) кодируется ядерными генами, была показана егохлоропластная локализация (Hsieh et al., 1998; Sugiyama et al., 2004). N-концеваяпоследовательность PII C. reinhardtii кодирует транзитный пептид, которыйопределяет локализацию в хлоропласте и отрезается у зрелого белка. Нами былопоказано, что как и PII-гомологи высших растений, зрелый CrPII локализован вхлоропласте (рисунок 11).
Что касается CvGLB1, то было выявлено, чтоимеющаяся в базе данных последовательность является неполной с N-конца, чтоне позволило определить транзитный пептид хлоропластной локализации. Вданной работе определен сиквенс всего гена GLB1 C. variabilis. Последующийсравнительный анализ аминокислотных последовательностей, а также результатыиммунодетекции (рисунок 17) предполагают хлоропластную локализацию белкаCvPII. До недавнего времени оставался открытым вопрос о роли С-концевого94удлинения в последовательностях PII-белков эукариот.
Данные кристаллографиибелка СrPII позволили выявить на С-конце небольшую структуру, Q-петлю(KMEG), которая оборачивается вокруг связанной молекулы глутамина инеобходима для глутамин-зависимого комплексообразования с N-ацетил-Lглутаматкиназой (Chellamuthu et al., 2014). Аналогичная аминокислотнаяпоследовательность была выявлена в белке CvPII (рисунок 35). Более того,проведенныйсравнительныйанализ аминокислотныхпоследовательностейуказывает на то, что в связи с делецией в пределах С-концевого участка PII-белкипредставителей сем. Brassicaceae (к которым принадлежит A.
thaliana) неспособны связывать глутамин (рисунок 35).Характерная консервативная последовательность В-петли [ST]-x(3)-G-[DY]G-[KR]-[IV]-[FW]-[LIVM], общая для всех прокариотических белков PII, такжесохраняется у высших растений и одноклеточных зеленых водорослей (рисунок16). Аминокислоты этой последовательности участвуют во взаимодействиимежду мономерами. Структурно PII высших растений и бактерий формируетфункциональный (гомо)тример (Mizuno et al., 2007). Данные гель-фильтрациирекомбинатных белков CrPII и CvPII показывают, что эти белки такжефункционируют как тримеры (рисунок 15, 23).Регуляция белков в клетках может осуществлять на трех уровнях –транскрипционном, трансляционном ипосттрансляционном.Поскольку внедавних исследования была показана некоторая регуляция белка PII A. thalianaна уровне транскрипции (Uhrig et al., 2009), нами был проведен тщательныйанализ экспрессии CrPII и CvPII на уровне транскрипции и трансляции.Полученные результаты указывают на то, что у C.
reinhardtii экспрессия CrGLB1увеличивается в гаметах (рисунок 12A). Известно, что свет необходим длядифференциации вегетативных клеток Chlamydomonas в компетентные гаметы вусловиях недостатка азота (Beck и Acker, 1992). Свет запускает сигналдифференциации прегамет (взятых из темноты и некомпетентных к спариванию)в функциональные гаметы (Pan et al., 1997). Использование мутанта lrg6,демонстрирующего формирование компетентных гамет в темноте (без светового95сигнала) (Dame et al., 2002), позволило доказать, что зависимая от светатранскрипция CrGLB1 не связана с контролем гаметогенеза.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
