Диссертация (1145822), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Идентификация и характеристика белка PII Chlorella variabilis (CvPII)3.2.1. Биоинформационный анализ первичной последовательности CvPIIС целью более полной характеристики свойств сигнальных белков PII уодноклеточных зеленых водорослей в качестве второго модельного объекта былавыбрана Chlorella variabilis NC64A, представляющая собой внутриклеточныйфотобионт Paramecium bursaria. Выбор данного объекта был сделан исходя издоступности литературных данных по физиологии и методологии данногомодельного объекта.
Кроме того, интересно было проанализировать роль белкаPII у зеленой водоросли с принципиально иной экологической средой обитания и,какследствие,отличнымтипомметаболизмаазотапосравнениюсвышеописанной C. reinhardtii.В недавно просеквенированном геноме C. variabilis NC64Aбыла выявленапоследовательность, кодирующая белок с высокой степенью идентичности спредставителями семейства PII-белков. Был проведен сравнительный анализаминокислотныхпоследовательностейPIIC.variabilis(EFN50797)ссоответствующими последовательностями охарактеризованных PII-белков C.reinhardtii, высших растений и бактерий с помощью программного обеспеченияClustalW (рисунок 16).61Рисунок 16. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей PII-белков C.variabilis, C. reinhardtii, растений и бактерий.
Chlamydomonas reinhardtii (Cr; XP_001703658.1),Arabidopsis thaliana (At; NP_192099.1), Oryza sativa Japonica (Os; NP_001054562.1), Solanumlycopersicum (Sl; AAR14689.1), Synechococcus PCC 7942 (Sy; P0A3F4.1), Synechocystis sp. PCC6803 (Sc; CAA66127.1), E. сoli (Ec; AP_003139.1). Выделенные черным остатки консервативныу 60% анализируемых PII-белков. Блоки I и II обозначают две консервативныепоследовательности субсемейства GlnB, PS00496 и PS00638. Белыми и черными стрелкамиобозначены позиции тирозиновых оснований, подвергающихся уридилированию в белке PII E.coli, и сериновых оснований, фосфорилируемых у Synechoccocus PCC 7942, соответственно.Основания, участвующие в связывании АТФ отмечены черными кружками, NAGK – чернымиквадратами, 2-ОГ – черными треугольниками. Выравнивание последовательностей проводилосьс помощью программного обеспечения ClustalW.Выявленная в базе данных последовательность CvPII укорочена с N-концапо сравнению с бактериальным белком (рисунок 16).
В регионе междуаминокислотами 103 и 189 CvPII, соответствующем бактериальным белкам,общий процент идентичности белка CvPII и PII E. coli составляет 48,5%. Крометого, в пределах этой области аминокислотная последовательность CvPII имеетвысокую степень идентичности с последовательностями PII у репрезентативныхпредставителей растений и цианобактерий, в том числе: С.
reinhardtii (65,7%), А.thaliana (54,7%), O. sativa Japonica (53,7%), Solanum lycopersicum (53,7%),Synechococcus PCC 7942 (53,9%) и Synechocystis sp. PCC 6803 (53,4%). Помимовысокой общей идентичности между различными PII-белками цианобактерий,растений и C. variabilis, чрезвычайно высокая локальная идентичностьнаблюдается в пределах двух характерных последовательностей, называемых62PROSITE (PS00496 и PS00638) (рисунок 16).
В первичной последовательностиCvPII, также как и в белках C. reinhardtii и некоторых высших растений,уридилируемый у протеобактерий Tyr-51, локализованный в области Т-петли,заменен остатком фенилаланина. Это указывает на то, что кодирующаяпоследовательность белка PII C. variabilis не содержат уридилируемого Tyr.Кроме того, в белке CvPII консервативный для цианобактерий фосфорилируемыйостаток Ser-49, аналогично белку PII C. reinhardtii, заменен на остаток треонина вэтом сайте (рисунок 16).
Это позволяет предположить, что белок CvPII также неможет модифицироваться путем фосфорилирования.Последовательность В-петли [SТ] -x (3) -G- [DY] -G- [KR] - [IV] - [FW] [LIVM], которая была обнаружена во всех прокариотических PII-белках, а такжебелках PII C. reinhardtii и высших растений, также сохраняется у C. variabilisNC64A. Этот мотив участвует в связывании АТФ между двумя соседнимисубъединицами тримерного белка PII. Кроме того, остатки, необходимые дляформированиябактериальныхирастительныхтримерныхструктурPII,сохраняются также у PII C. variabilis (рисунок 16).
Эти данные могут указывать нато, что CvPII образует гомотримеры, как и другие белки этого семейства. Крометого, остатки, участвующие в связыванииэффекторных молекул, такжесохраняются в пределах последовательности CvPII.Примечательно, что белок CvPII C. variabilis, так же как и PII-гомологи C.reinhardtiiивысшихрастений,имеетуникальнуюС-концевуюпоследовательность, которая отсутствует у прокариотических PII-белков. Однаков отличие от белков семейства, охарактеризованных у высших растений и C.reinhardtii, в приведенной последовательности CvPII отсутствует уникальная Nконцеваяпоследовательность,котораясодержитсигнальныйпептид,определяющий хлоропластную локализацию PII-белков фототрофных эукариот.
Украсных водорослей гены, кодирующие PII, локализованы в хлоропластномгеноме и их белки не имеют N-концевых сигнальных пептидов (Uhrig et al., 2009).Однако поскольку ген, кодирующий у C. variabilis анализируемый белок,находится в ядерном геноме, было выдвинуто предположение, что в приведенной63последовательности CvPII не хватает уникального N-концевого участка,содержащего сигнальный пептид. Для подтверждения данного предположениянеобходимо было определить молекулярную массу белка CvPII в клетках C.variabilis.3.2.2. Иммунологическая идентификация CvPIIУчитывая высокую идентичность первичных последовательностей PIIбелков C.
reinhardtii и C. variabilis, полученные ранее антитела, специфичные кCrPII (Ermilova et al., 2013), были использованы нами для идентификации PII C.variabilis методом Вестерн-блоттинга (рисунок 17).Рисунок 17. Иммунологическая идентификация CvPII методом Вестерн-блоттинга сиспользованием CrPII-специфичных антител.
1 - стандартный маркер молекулярных размеров(кДа); 2 - 10 мкг растворимых белков клеточного экстракта C. reinhardtii; 3 - 20 мкграстворимых белков клеточного экстракта C. variabilis.Как видно из полученных результатов, антитела специфично реагировали сбелком C. variabilis. Примечательным является тот факт, что, как и у C.reinhardtii,в реакции были выявлены две формы белка: с молекулярнымимассами около 22 кДа и 17 кДа. У C.
reinhardtii эти формы соответствуютнепроцессированномуипроцессированному,зреломубелку,которыйлокализован в хлоропласте. Молекулярная масса, рассчитанная для CvPII наоснове последовательности EFN50797, составляет всего 11358,96 Да. Т.о.,выявленное несоответствие размеров PII C. variabilis, рассчитанного на основеимеющейся в базе данных последовательности, и полученного с помощью64Вестерн-блоттинга, дополнительно свидетельствует о необходимости коррекциипоследовательности данного белка.
В связи с этим была проведена работа поанализу недостающей последовательности гена.3.2.3. Определение последовательности кодирующей цепи ДНК CvPIIПо причине высокой степени сложности генома C. variabilis ряд широкоиспользуемых молекулярных методов (Blanc et al., 2010) не позволил выявитьполностью последовательность, кодирующую белок PII. Для определенияпоследовательности, смежной с известной частью гена, был оптимизирован методПЦР, который позволяет последовательно и эффективно амплифицироватьпродукт с достаточным уровнем качества для непосредственного секвенирования.Эта техника ПЦР-амплификации основана на случайном распределении сайтовчастощепящих рестриктаз в геноме и специальном дизайне праймеров (GonzálezBallester et al., 2005). Все шаги, циклы, теоретически ожидаемые продукты, атакже используемые праймеры приведены на рисунке 18.Четыре сайта рестрикции (PvuII, BanI, PstI и TaqI) были использованы длядизайна соответствующих праймеров.
Чтобы уменьшить вероятность нахожденияэтих сайтов в геноме, при дизайне праймеров был также добавлен одиндополнительный нуклеотид после сайта рестрикции на 3'-конце. Полученныепосле второго раунда амплификации конкретные продукты, которые выявлялисьна геле в виде полос высокой интенсивности, непосредственно секвенировались.В результате ПЦР на матрице геномной ДНК с использованием пар праймеровDegTaqI/GLB1R2 и Q0/GLB1R1 был изолирован фрагмент размером 2196 п.н.,последовательность которого соответствует гену, который был обозначен какCvGLB1 (GenBank: KJ524571). Амплификация внутреннего фрагмента размером896 пар нуклеотидов (GLB1F1/GLB1R1) указывает на специфичность ПЦРпродукта.65Рисунок 18. Схема метода ПЦР-амплификации, основанного на случайном распределениисайтов частощепящих рестриктаз.А Схематически обозначенные позиции праймеров и потенциальных сайтов рестрикции.Известная часть гена обозначена серым прямоугольником.Б Схема ожидаемых ПЦР-продуктов после первого и второго раундов амплификации,реамплификации и проверки специфичности.
В дегенеративных праймерах последовательностьQ0 обозначена курсивом, а соответствующая сайту рестрикции последовательность выделенажирным шрифтом66Как показано на рисунке 19, кодирующая область гена CvGLB1 содержитшесть интронов и семь экзонов. Размер интронов колеблется от 87 до 348 п.о.Сайты сплайсинга экзон/интрон и интрон/экзон согласуются с консенсуснымимотивами G↓GTGAG и (С/А)CAG↓G (инвариантные основания выделеныжирным шрифтом), характерными для ядерных генов (Blanc et al., 2010). Наследующем этапе, в результате ПЦР-амплификации на матрице кДНК сиспользованиемпраймеровGLB1F3/GLB1R3,GLB1F4/GLB1R4иGLB1F5/GLB1R5, сконструированных для разных экзонов, были полученыфрагменты ожидаемых размеров – 71 п.о, 120 п.о и 203 п.о., соответственно(рисунок 19, таблица1). Кодирующая последовательность ДНК (CDS)соответствовала белку из 210 аминокислот с расчетным размером 21,96 кДа.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
