Диссертация (1145822), страница 7
Текст из файла (страница 7)
По-видимому, PII урастений также участвует в регуляции запасания белков в семени, хотя деталиэтого процесса еще предстоит выяснить (Uhrig et al., 2009).* * *Обобщая имеющийся в литературе материал, следует отметить, чтопредставители семейства PII-белков высоко консервативны по своей структурнойорганизации и обнаружены во всех трех доменах жизни – у архей, бактерий ифотосинтезирующих эукариот. Сигнальные белки PII участвуют в регуляцииметаболизма азота путем белок-белковых взаимодействий с широким набороммишеней, таких как белки-транспортеры, регуляторы транскрипции и ферменты.Ключевые составляющие путей ассимиляции азота в клетках сходны у многихорганизмов, однако детали регуляции могут существенно отличаться.
В клеткахпрокариотролькоординаторовицентральныхрегуляторовпроцессовметаболизма азота и углерода выполняют сигнальные белки из семейства PII.Крометого,имеющиесяэкспериментальныеданныеуказываютна36непосредственное участие белков PII в восприятии энергетического статусаклеток.На протяжении многих лет большая часть исследований была посвященавыяснению роли PII-белков у гетеротрофных прокариот, тогда как только впоследние годы достигнуты некоторые успехи в изучении функций РII-белков уцианобактерийинекоторыхвысшихрастений.Несмотрянавысокуюконсервативность структуры представителей этого семейства обращает вниманиеразнообразие мишеней и, как следствие, спектр выполняемых функций в клеткахразных организмов. Показано, что у PII-белков организмов с оксигенным типомфотосинтеза появились дополнительные клеточные мишени: наиболее изученнойу них консервативной функцией белков PII является контроль биосинтезааргинина за счет регуляции фермента N-ацетил-L-глутаматкиназы (NAGK).Несмотря на некоторые важные различия в деталях обращает вниманиепоразительное функциональное сходство взаимодействия NAGK-PII междуразличнымидоменамижизни.Подобнаяконсервативностьрегуляцииаргинин/орнитинового пути биосинтеза у фотосинтезирующих организмовсвидетельствует о сильном эволюционном давлении отбора в пользу сохранениявзаимодействия NAGK-PII.
Более того, представляется вероятным, что в ходеэволюционного развития организмов произошла смена функций белка PII – отцентральной в координации процессов метаболизма азота и углерода у прокариотк более узко специализированной в регуляции биосинтеза аргинина и жирныхкислот в хлоропластах высших растений. На сегодняшний день имеетсязначительныйпробелфотосинтезирующихвпониманииэволюционногопереходаотпрокариот (цианобактерии) к высшим эукариотам(растения), заполнить который помогут исследования структуры и функциибелков PII в клетках одноклеточных зеленых водорослей. Кроме того,характерной особенностью PII-белков растений является наличие С-концевогоудлинения в 13-19 аминокислот.
В связи с этим возникал вопрос обэволюционном происхождении этого С-концевого участка и его функциональномзначении. Для изучения вышеупомянутых проблем в работе использованы37одноклеточные зеленые водоросли Chlamydomonas reinhardtii и Chlorellavariabilis, метаболизм которых достаточно хорошо изучен и для которыхразработаны методы генетического и молекулярно-биологического анализа.38ГЛАВА 2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ2.1. Объекты исследования и условия культивированияИспользованный в работе штамм Chlamydomonas reinhardtii СС-124(nit1agg1mt-) любезно предоставлен проф. Э. Харрис (Коллекция КультурChlamydomonas Университета г. Дюк, США); штамм Chlamydomonas reinhardtiiCF59 (lrg6) с независимым от света гаметогенезом любезно предоставлен проф.С. Бэк (г. Фрайбург, Германия); штаммы дикого типа дикого типа 6145с и 621mt+любезно предоставлены профессорами Э. Фернандесом (Испания) и С. Пуртоном(Англия), соответственно.
Chlamydomonas reinhardtii выращивалась в среде ТАР(Gorman и Levine, 1965) следующего состава (мл/л): раствор Бейринка (NH4CI –15 г/л; К2НРO4 – 0.2 г/л; Mg2SO4·7H2O – 4.0 г/л) – 100; фосфатный буфер(К2НРO4 – 7.17 г/л, КН2РO4 – 3.63 г/л) – 100; Трис-ацетат – 20; микроэлементы(ZnSO4·7H2O – 0.022 г/л; MnSO4 – 1.81 г/л; CuSO4·5H2O – 0.079 г/л; CoCl2 – 1.2г/л; NаВО3·4Н2O – 2.63 г/л; (NH4)6Mo7O24·4H2O – 1 г/л;FeSO4·7H2O – 9.3 г/л;Са(NО3)2 – 0.02 г/л; ЭДТА (трилон В) – 10 г/л) – 1 (pH среды 7,0). Вэкспериментах использовались культуры, выращенные синхронно в режимеосвещения люминесцентными лампами 12 ч свет : 12 ч темнота при 23°С(освещенность ~ 30 μmol m-2 s-1).
Для опытов культуры пересевались каждые 72часа.Штамм Chlorella variabilis NC64A был любезно предоставлен проф. ВанИттеном (Университет г. Небраска-Линкольн, США). Chlorella variabilisвыращивалась в среде MBBM (Van Etten et al., 1983; Nichols и Bold, 1965)следующего состава (мл/л): CaCl2 (2.5 г/л)– 10, MgSO4(7.5 г/л)– 10, K2HPO4 (7.5г/л) – 10, KH2PO4 (17.5 г/л) – 10, NaCl (2.5 г/л) – 10, EDTA (50 г/л)+KOH (31 г/л)–1, FeSO4 (4.98 г/л) – 1, H3BO3(11.42 г/л) – 1, микроэлементы (ZnSO4·7H2O – 8.82г/л, MnCl2·4H2O – 1.44 г/л, MoO3– 0.71 г/л, CuSO4·5H2O – 1.57 г/л, Co(NO3)2·6H2O– 0.49 г/л) – 2. Культивирование проводили на свету (~ 30 μmol m-2 s-1) спостоянном покачиванием при температуре 25°C.
Скорость роста определяласьпри выращивании на средах с разными источниками азота: среда BBM (MBBMN), содержащая NH4Cl (25 мM), аргинин (2, 10 или 15 мM) или глутамин (2, 1039или 15 мM). Количество клеток оценивалось с использованием камеры Горяева.Скорость роста определялась как число клеточных удвоений в час. Размерыклетокопределисьмикроскопически(LeicaTCS-SP5,Leica-Microsystems,Германия) с использованием программного обеспечения Leica Application.2.2. Получение прегамет и гамет Chlamydomonas reinhardtiiДля получения прегамет (незрелых гамет) вегетативные клетки переносили всреду TAP-N в начале световой фазы культивирования, и инкубировали 24 часа втемноте.
Гаметы получали путем освещения прегамет в течение 2 ч.Определение процента образовавшихся гамет проводили путем смешиванияисследуемыхгаметсгаметамиштамма-тестера противоположноготипаспаривания в соотношении 1:3; через 1 ч инкубации клетки фиксировалидобавлением0,5%глутаровогоальдегида.Количестводвух-ичетырехжгутиковых клеток подсчитывали под микроскопом. Процент зрелыхгамет, способных к формированию зигот, рассчитывали по формуле (Beck и Acker1992):1a 100%B 2QQгдеQ–количествочетырехжгутиковыхклеток;B–количестводвухжгутиковых клеток; a – коэффициент, определяемый как отношениеколичества тестируемых гамет к общему количеству гамет.2.3.
Определение концентрации хлорофиллаДляопределенияконцентрациихлорофилла0,6млкультурыцентрифугировали (3 мин, 5000g) и ресуспендировали в 80% ацетоне, затемперемешивали на вортексе и центрифугировали (5 мин, 12000g). Поглощениесупернатанта измеряли при длине волны 652 нм. В случае Chlorella variabilis дляполной экстракции пигментов был введен дополнительный этап разрушенияциркониево-кремниевыми шариками (диаметр 0,1 и 0,5 мм) на гомогенизаторе40Minilys (Bertin Technologies, Франция). Концентрацию хлорофилла (мг/мл)рассчитывали по описанной ранее формуле (Arnon, 1949):С = A652/34.52.4. Выделение тотальной РНК30млсуспензииклетокChlorellaилиChlamydomonasосаждалицентрифугированием (5000g, 5 мин), ресуспендировали в 0,5 мл тризола (Trizol,Invitrogen, США) и перемешивали.
Клетки Chlorella подвергали дополнительномуразрушению циркониево-кремниевыми шариками (диаметр 0,1 и 0,5 мм) сиспользованиемMinilys(BertinTechnologies,Франция).Гомогенизатинкубировали 5 мин при 20°C, добавляли 0,1 мл хлороформа, встряхивали 15 секи вновь инкубировали 5 мин при 20°C. Смесь центрифугировали (12000g, 4°C, 15мин), верхнюю водную фазу отбирали в новую пробирку и добавляли 0,25 млизопропилового спирта. Инкубировали 10мин при 20°C, далее центрифугировали(12000g, 4°C, 15 мин). Супернатант удаляли, к осадку добавляли 0,5 мл 75°этанола, перемешивали и центрифугировали (7500g, 4°C, 5 мин).
Осадоквысушивали и растворяли в DEPC (Diethylpyrocarbonate) (Amresco, США) воде.РНК хранили при -70°C.2.5. Метод ПЦР, OT-ПЦР и ПЦР в режиме реального времениВ состав реакционной смеси ПЦР объемом 25 мкл входили следующиекомпоненты:0,2μМкаждогопраймера;40μМсмесидезоксинуклеозидтрифосфатов; 0,5 ед.
Taq ДНК-полимеразы (СибЭнзим, Россия)(0,1мкл); 0,4 мкл ДНК; 2,5 мкл реакционного буфера. Условия реакции:денатурация ДНК (95°C, 5 мин); 39 циклов, состоящих из денатурации ДНК(95°C, 30 с), отжига праймеров (55-65°C, 30 с), синтеза цепи ДНК (72°C, 1 мин);дополнительныйсинтезвизуализировалисДНКпомощью(72°C,3мин).электрофорезавПродуктыПЦР-реакции1,5%-агарозномгелесиспользованием бромистого этидия. Анализ гелей проводился с помощьюоптической системы GelDoc (Upland, США).41Одноцепочечная кДНК была получена на матрице РНК с использованиемнабора для обратной транскрипции (RevertAid H Minus First Strand cDNASynthesis Kit, ThermoScientific, США) согласно рекомендациям производителя.Перед синтезм кДНК РНК обрабатывали ДНКазой I (ThermoScientific, США)(37°C, 15 мин).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
