Диссертация (1145822), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Было показано, что в присутствиименее предпочтительных источников азота, таких как нитрат, и низких уровнейАТФ в клетках транскрипционный регулятор TnrA и белок GlnK формируюткомплекс с транспортером AmtB (Heinrich et al., 2006). В этих условияхэкспрессируются гены glnRA, кодирующие GS и регулятор транскрипции GlnR,что приводит к внутриклеточному синтезу глутамина. TnrA слабо репрессируетоперон glnRA. Ряд экспериментальных данных указывает на то, что GS у Bacillussubtilis функционирует как сенсор уровней азота (Fisher, 1999; Wray et al., 2001).
Вусловиях избытка азота, обратимо ингибированная глутамином и АМФ GS (FBIGS) связывается и ингибирует регулятор TnrA. Кроме того, FBI-GS стабилизируетсвязывание GlnR с промоторами генов tnrA и glnRA, что приводит к репрессиисоответствующих генов (рисунок 6).Рисунок 6. Контроль ассимиляции азота у B.
subtilis. Пояснения в тексте. (По: Gunka иCommichau, 2012).25Кроме того, клеточные уровни TnrA регулируются путем протеолиза(Kayumov et al., 2008). После перенесения клеток Bacillus на среду безметаболизируемого источника азота TnrA высвобождается и подвергаетсяпротеолизу в течение 15 минут. В этих условиях GS должна быть в высокоактивном, не ингибированном состоянии, что снижает ее сродство к TnrA. Этоприводит к тому, что TnrA распознается протеазами и деградирует.
Однако, когдаTnrA находится в комплексе с GS до удаления из среды источника азота, как и вслучае с мутантом по GlnK, TnrA остается связанным и защищен от протеолиза(Kayumov et al., 2011).Анализ последовательностей по базам данных выявил также наличие glnBподобныхгеновуClostridiumacetobutylicum,Clostridiumcellobioparum,Clostridium longisporum и Listeria monocytogenes (Brown и Thomson, 1998).Актинобактерии.
Регуляция метаболизма азота достаточно хорошоизученанапримерекоммерческиважногопродуцентааминокислот–Corynebacterium glutamicum (Burkovski, 2007; Ермилова, 2012). Подобноэнтеробактериям C. glutamicum ассимилирует аммоний двумя основнымиспособами – по GS/GOGAT и GDH путям.
Активность GS, кодируемой геномglnA, также контролируется путем посттрансляционного аденилирования/деаденилированиябифункциональнымферментомGlnE.ОднакоGlnЕфункционирует независимо от GlnD. Адаптация C. glutamicum к условиямнедостаткаазотанауровнетранскрипцииконтролируетсяглобальнымрегулятором AmtR, который в условиях достаточного обеспечения азотомрепрессирует ряд генов, в том числе оперон amtBglnKglnD. Однако припоявлении достаточного количества азота в среде AmtR взаимодействует снаходящимся в цитоплазме сигнальным трансдукторным белком GlnK, врезультате он теряет способность взаимодействовать с ДНК и снимаетсярепрессия соответствующих генов (Jakoby et al., 1999; Jakoby et al., 2000; Nolden etal., 2001).
Для актинобактерий характерно наличие единственного PII-гомолга(GlnK). Было показано, что с AmtR взаимодействует только модифицированная26форма GlnK (Beckers et al., 2005; Strosser et al., 2004). Подобно энтеробактерияммодификация GlnK осуществляется по остатку Tyr-51 Т-петли ферментом GlnD(Nolden et al., 2001). Однако позднее выяснилось, что GlnD C.glutamicumфункционирует как аденилилтрансфераза в отличие от уридилтрансферазы E.coli(Strosser, 2004).
Позднее аденилирование белка PII было также показано наStreptomyces coelicolor (Hesketh et al., 2002). Т.о., актинобактерии демонстрируютеще один способ посттрансляционной модификации белков PII – аденилирование.GlnDC.glutamicumфункционируеткакбифункциональныйфермент,атранскрипция его гена (glnD) возрастает в условиях недостатка азота. Эти данныеуказывают на то, что GlnD не является первичным сенсором азотного статусаклетки у C.glutamicum (Nolden et al., 2001, Burkovski, 2007).Помимо посттрансляционной модификации для белка GlnK C. glutamicumбыло показано изменение внутриклеточной локализации в ответ на изменениеуровней азота в среде. В то время как при азотном голодании GlnK представлен вцитоплазме, при добавлении аммония около 2-5% этого белка секвестрируется кцитоплазматической мембране с участием транспортера аммонияAmtB.Подобный механизм связывания GlnK с AmtB оказался достаточно консервативени широко распространен среди других бактерий, таких как E.coli, B.
subtilis,Azotobacter vinelandii (Coutts et al., 2002; Detsch и Stülke, 2003; Javelle et al., 2004).Было показано, что при добавлении аммония основная часть GlnK подвергаетсяпротеолизу, тогда как 2-5% не деградирует. Детали данного процесса пока неясны, однако было показано, что и протеолиз GlnK у C.glutamicum и защита отдеградации у других бактерий зависят от присутствия пермеазы аммония AmtB(Burkovski, 2007). Схематическое изображение регуляции метаболизма азота уC.glutamicum представлено на рисунке 7.27Рисунок 7.
Регуляция метаболизма азота C.glutamicum. Пояснения в тексте. (По: Burkovski,2007).Т.о., механизмы контроля метаболизма азота у C.glutamicum с участием PIIбелка GlnK включают как уровни регуляции экспрессии генов, так и активностибелков, и осуществляются путем репрессии транскрипции, белок-белковыхвзаимодействий,модификациипутемаденилирования,изменениявнутриклеточной локализации и протеолиза.В последние годы в литературе также появились данные по исследованиюроли PII у микобактерий. Так, было показано, что в геноме патогена M.tuberculosis присутствует единственный представитель PII-белков, имеющий61,1% идентичности белку GlnB и 54% идентичности белку GlnK E.coli (Cole etal., 1998). Однако, после определения кристаллической структуры PII M.tuberculosis была показана структурная консервативность с GlnK-белками.
Крометого, колокализация соответствующего гена в одном опероне с amtB и glnDдополнительно указывает на то, что PII M.tuberculosis является представителемсубсемейства GlnK, а не GlnB (Shetty et al., 2010). Относительно недавно былиполучены экспериментальные доказательства того, что GlnK микобактерий28(непатогенного M. smegmatis и патогенного M. tuberculosis), как и у другихактиномицетов,подвергаетсяпосттрансляционноймодификациипутемаденилирования по Tyr-51 в условиях недостатка азота (Williams et al., 2013).GlnD был выявлен как фермент, осуществляющий реакцию аденилирования.Также было показано, что состояние аденилирования GlnK M.
tuberculosis нерегулирует аденилирование GS, но в отличие от PII E.coli и С. glutamicum, неопосредует транскрипционный ответ клетки в условиях недостатка азота(Williams et al., 2013).1.3. PII архейУпредставителейархей,обладающихспособностьюкфиксацииатмосферного азота, были выявлены белки NifI из семейства PII. Большинствоисследований по изучению контроля активности нитрогеназы архей быловыполнено на Methanococcus maripaludis и был показан принципиально иной отАДФ-рибозилированиямеханизмрегуляцииэтогофермента.ВгеномеM.maripaludis находится 5 генов, кодирующих PII-белки, два из которых nifI иnifI2 локализованы между генами nifH и nifD, кодирующими субъединицыдинитрогеназы/редуктазы динитрогеназы (Kessler и Leigh, 1999). В отличие отпротеобактерий, для которых характерна PII-зависимая регуляция редуктазыдинитрогеназы (NifH), у архей контроль осуществляется через динитрогеназу(NifDK).
Было показано, что ингибирующий эффект NifI1и NifI2на нитрогеназуосуществляется при прямом взаимодействии гетеромера NifI1/NifI2 с компонентомNifDK (рисунок 8). Это взаимодействие нарушается в присутствии 2-ОГ, которыйпровоцирует дальнейшую олигомеризацию NifI1/NifI2 (Dodsworth и Leigh, 2006).Связывание гетеромерного NifI1/NifI2 с NifDK предотвращает ассоциациюпоследнего с NifH, что приводит к прерыванию электрон-транспортной цепи(Dodsworth и Leigh, 2007).
Т.о., в условиях фиксации азота наблюдаются высокиевнутриклеточные концентрации 2-ОГ, который связывается с NifI и усиливаетформирование олигомеров NifI1/NifI2 более высокого порядка (вероятно,додекамеров), что препятствует их взаимодействию с NifDK. При появленииаммония внутриклеточные концентрации 2-ОГ падают, а гетеромер NifI1/NifI229превращается в олигомер с меньшей молекулярной массой (вероятно, гексамер),который взаимодействует с NifDK, предотвращая взаимодействие с NifH, врезультате чего нитрогеназа инактивируется (рисунок 8) (Huergo et al., 2012).Рисунок 8.
Роль PII в регуляции активности нитрогеназы у архей. Пояснения в тексте. (По:Huergo et al., 2012).Следует отметить, что nifI-гены представлены у всех азотфиксирующихархей и у некоторых анаэробных бактерий, включая представителей Proteobacteria, Firmicutes, Chlorobi, Chloroflexi. Наличие nifI-генов как у архей,так и у бактерий предполагает их раннее эволюционное происхождение. СогласносовременнымнитрогеназыпредставлениямявляетсяNifI1/NifI2-зависимыйэволюционноболееконтрольдревнимпоактивностисравнениюспосттрансляционным способом регуляции нитрогеназы (Huergo et al., 2012).Кроме того, среди представителей Euryarchaeota достаточно широкораспространены GlnK-белки. Так, например, в геноме M.
mazei содержатся геныдля белков glnK1 и glnK2, для которых характерна колокализация в одномопероне с amtB, хотя долгое время не было экспериментальных доказательств ихвзаимодействия в клетках архей (Leigh и Dodsworth, 2007). Однако недавно натаком объекте как Haloferax mediterranei было показано, что аммониевый шокприводит к ассоциации GlnK с AmtB на мембране, подтверждая предположение оконсервативности пары GlnK-AmtB в качестве сенсора азота у архей (Pedro-Roiget al., 2013в). По аналогии с бактериями археотный GlnK может блокироватьтранспортер аммония AmtB1 в богатых по азоту условиях.
Более того, была30показана регуляция на уровне транскрипции для пары генов amtB-glnK у архей взависимости от количества доступного азота. При недостатке азота наблюдалисьвысокие уровни экспрессии, тогда как появление метаболизируемого источникаазота приводило к значительному снижению транскрипции. Однако, несмотря наконсервативность регуляции уровней транскриптов этой пары генов посравнению с бактериями, у архей не было выявлено ни характерной для бактерийдвухкомпонентной регуляторной системы NtrB-NtrC, ни 54-фактора, в связи счем авторы предположили наличие отличного механизма контроля транскрипции(Pedro-Roig et al., 2013в). Также в серии работ этой исследовательской группыбыло показано, что GlnK Hfx.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
