Диссертация (1145822), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Инактивировали ДНКазу I нагреванием (80°C, 10 мин). Всеиспользованные в работе праймеры для количественной ПЦР в режиме реальноговремени давали эффективность реакции ≥90% и единственный пик на кривойплавления (таблица 1). Каждая реакция содержала 0,2 μМкаждого праймера;40μМ смеси дезоксинуклеозид трифосфатов; 2,5 мкл реакционного буфера; 2,5мМ MgCl2; 0,1 ед. HotTaq ДНК-полимеразы (СибЭнзим, Россия); 5 % DMSO; 1,25мкл SYBRGreenI; 200-300 мкг кДНК. Количественная ПЦР врежиме реальноговремени выполнялась на термоциклере LightCycler (CFX96 Real-Time PCRDetection System, BioRad, США) с использованием SYBRGreenI в качествефлюоресцентного красителя.
Условия реакции: денатурация ДНК (95°C, 3 мин);39 циклов, состоящих из денатурации ДНК (95°C, 30 с), отжига праймеров (5565°C, 30 с), синтеза цепи ДНК (72°C, 1 мин). Все реакции были выполнены в трехповторах на пробах из, как минимум, двух биологических выделений. Контролибез матрицы или обратной транскрипции были включены. Значение Ctопределялось как номер цикла, на котором флюоресцентный сигнал реакциипересекает базовую линию, с использованием программного обеспеченияCFXManager. Относительная разница уровней экспрессии генов вычислялась поформуле:Δ = 2-(Ctопыт-Ctконтроль)Для статистической обработки полученных данных использовался пакетофисных программ MicrosoftExcel.Таблица 1. Последовательности праймеров для амплификации.ПраймерCrGLB1 прямойПоследовательность (5'-3')GGCGTCAAGTTCTTCCGCAT42CrGLB1 обратныйGGTTGGAGGGACCGAACTCACrUBI прямойGTACAGCGGCGGCTAGAGGCACCrUBI обратныйAGCGTCAGCGGCGGTTGCAGGTATCTCrAMT1;1 прямойGCACGGGAGGGCAAGAGGTTCCrAMT1;1 обратныйATGTGCCGCAGTCAAGAAGGATTTCvGLB1F6 прямойCATACGCGGCATGACTGTGCvGLB1R6 обратныйGCCTTCTCCACCAGGAACTGCvUBI прямойGGCGTGGAGAAAGGACAAGCCvUBI обратныйGGATGTAGCACTTCCACCGCCvAMT1 прямойGGCTTCTTTGCAACACAGACCCvAMT1 обратныйCAGCACCAGAAACATTCCCGCCvEF1A прямойGCGACAGACAGGACACAATGGCvEF1A обратныйCGAAGGAAGACTTGCCCAGGCvGPD1 прямойGCGCAGACATGTTTGTGGGCvGPD1 обратныйCGGCAATCAGCTTGACAGCCvMDH3 прямойCGCAAAGTCGCCGTACTAGGCvMDH3 обратныйGCCTTGCTGTTGATGTGGCCvPYK прямойAGTGGCCAAGACCAAGATCGCvPYK обратныйGTGCGGTGGTACTCAATGGGCvCBLP прямойACACCAAGGACGTGCTGTCGCvCBLP обратныйCGATCGTGTACTTGCACTCGCCvACT прямойTGTTGTGGTCGTGGATCTTGGCvACT обратныйTCCTTCGTGTCCAGCATTGC43CvGLB1F3 прямойAGTTGGGTGCAGCTTCTCGCvGLB1F3 обратныйCTGCTAGGGCTTGCCTGACCvGLB1F4 прямойCTGCACGTCTGCAACTCGCvGLB1F4 обратныйCTCCACCCGGAAGAAGTTGCvGLB1F5 прямойATGACTGTGTCGGACGTCAACvGLB1F5 обратныйATCTTTCCGTCCCCGATCT2.6.
Клонирование и секвенирование ДНК-фрагментовДля изоляции геномной ДНК 30 мл культуры клеток Chlorellа излогарифмическойфазыростацентрифугировали(5000g,5мин)иресуспендировали в лизирующем буфере (50 мMтрис-HCl (pH 7.5), 300 мM NaCl,10 мM ЭДТА, 4% SDS). Клетки Chlorella разрушали циркониево-кремниевымишариками (0,1 и 0,5 мм) с использованием Minilys (BertinTechnologies, Франция).Этапы ПЦР и последовательности праймеров для выявления недостающейпоследовательности гена CvGLB1 приведены на рисунке 18 в разделе 3. ПЦРамплификация выполнялась по описанной ранее методике (Liu et al., 1995).Специфические ПЦР-продукты изолировали из агарозного геля с использованиемнабора для экстракции ДНК (QIAquick Gel Extraction kit, QIAGEN, Германия),клонировали в вектор для клонирования ПЦР-продуктов pAL-TA (Евроген,Россия) и трансформировали в клетки E.
coli DH5α. Секвенирование ДНКфрагментов проводили с использованием стандартных для pAL-TA праймеров сиспользованием набора для секвенирования (BigDye (R) Terminator v3.1 CycleSequencing Kit, LifeTechnologies, США) на автоматическом секвенаторе (модель3500xL Genetic Analyzer, LifeTechnologies, США). Все реакции секвенированиябыливыполненынабазересурсногоцентраСанкт-Петербургскогогосударственного университета.Размер соответствующих фрагментов кодирующей последовательностиCvGLB1 проверяли на матрице кДНК с использованием пар праймеров44GLB1F3/GLB1F3 (размер ПЦР-фрагмента 71 bp), GLB1F4/GLB1F4 (120 bp),GLB1F5/GLB1F5 (203 bp). Последовательности праймеров приведены в таблице 1.Продукты ПЦР-реакции визуализировали с помощью электрофореза в 1-2%агарозном геле с использованием бромистого этидия.
Анализ гелей проводился спомощью оптической системы GelDoc (Upland, США).2.7. Выделение тотального белка и определение его концентрации30 мл суспензии клеток Chlamydomonas или Chlorella центрифугировали(5000g, 5 мин) и ресуспендировали в 300 мкл буфера А (0,1 М DTT, 0.1M Na2CO3).Затем добавляли 200 мкл буфера В (5% SDS, 30% сахарозы). Гомогенизировалиобразцы путем перемешивания на вортексе в течение нескольких минут. КлеткиChlorella подвергали дополнительному разрушению циркониево-кремниевымишариками (диаметр 0,1 и 0,5 мм) с использованием Minilys (Bertin Technologies,Франция).
Концентрацию экстрагированного белка определяли методом самидочерным (Popov et al., 1975). Для построения калибровочной кривойиспользовали растворы БСА с известными концентрациями.2.8. Вестерн-блоттингРазделениебелковпроводилосьметодомэлектрофорезав12-15%полиакриламидном геле (ПААГ) с SDS (Laemmli, 1970) (90 мин, 100V). С ПААГбелки переносились на нитроцеллюлозную мембрану (KarlRoth) полусухимметодом с использованием системы Транс-блот (BioRad, США) (60 мин, 20V).Неспецифическое связывание антител с мембраной блокировалось путеминкубации в 5% обезжиренном сухом молоке (в TBS буфере) при постоянномперемешивании в течение 1ч. Далее проводилась гибридизация с первичнымиантителами в течение 2ч. В работе использовались специфичные первичныеантитела к CrPII, α-CGE1, HSP70B, NAB1 (Agrisera, Швеция), AOX1(Agrisera,Швеция).
Антителак CrPII были получены Pineda Antikörper-Service (Берлин,Германия). Специфические антитела к α-CGE1 и HSP70B любезно предоставленыдоктором М. Шрода (Институт молекулярной физиологии растений общества45Макса Планка, Потсдам, Германия). В работе использовали следующиеразведения антител: 1:5000 анти-CrPII, 1:10000 анти-NAB1, 1:10000 анти-AOX1,1:10000 анти-HSP70B, 1:6000 анти-α-CGE1. На следующем этапе мембранаподвергалась гибридизации в течение 1ч с вторичными антителами кролика,конъюгированными с пероксидазой хрена (Sigma, США) (разведение 1:10000).Детекциюпероксидазнойактивностипроводилисиспользованиемхемилюминисцентного субстрата (Roche, Германия). Для регистрации сигналаиспользовали рентгеновскую пленку (Kodak, США).2.9.
Изоляция хлоропластов из клеток Chlamydomonas reinhardtiiИзоляцию хлоропластов проводили по описанной ранее методике (Klein etal., 1983). Клетки Chlamydomonas reinhardtii, предварительно обработанныеавтолизином, для удаления клеточной стенки, инкубировали с 0,004% (w/v)дигитонином (Sigma, США) в растворе лизирующего буфера (5 мМ K-фосфатныйбуфер (pH 6,5), 6% PEG (w/w), 4 мг/мл БСА) и прогревали при 40°С в течение 1мин. Хлоропласты отбирали после градиентного центрифугирования из зоны,расположенной на границе 45 и 70% перколла.
Затем полученные хлоропластыресуспендировали в лизирующем буфере и обрабатывали как целые клеточныеэкстракты.Для получения автолизина клетки штаммов 620 (mt-) и 621 (mt+) выращивалив среде TAP, после чего для индукции гаметогенеза клетки ресуспендировали всреде TAP-N без азота и инкубировали 24 ч при постоянном освещении. Гаметыпротивоположныхтиповспариваниясмешивали,концентрировалицентрифугированием (5 мин, 5000g) до концентрации ~3х107 кл/мл иинкубировали 1 час на свету.
После этого клетки осаждали центрифугированием(5 мин, 5000g), а супернатант с автолизином отфильтровывали через мембранныйфильтр с диаметром пор 0,2 мкм (Millipore, США). Для проверки качестваполученного фермента, к 1х107 кл/мл добавляли 50 мкл автолизина иинкубировали 30 мин. После чего клетки лизировали путем добавления 50 мкл0,5% Тритона Х-100, и определяли процент разрушенных клеток в камере Горяева46под микроскопом. В опытах использовали препараты, которые приводили клизису 90% клеток.2.10. Определение активности глутаминсинтетазы (GS)Cуспензию клеток Chlorella (20 мкг хлорофилла) центрифугировали (3000g,5 мин) и ресуспендировали в 0,8 мл раствора 1 (HEPES 66.7 мM (pH 7.0), Lглутамин 40 мМ, MnCl2 4 мM, АДФ 0.5 мM).
Замораживали на 10 мин (-70°С).После размораживания вносили 0,1 мл свежеприготовленного раствора 2(1.2М:1.2М гидроксиламин хлорид:NaOH) перемешивали на вортексе в течение10 с. Далее вносили 50 мкл раствора 3 (Na2HAsO4*7H2O 124,8 мг/мл),перемешивали на вортексе и инкубировали суспензию на свету при 30°Свтечение 10 мин. После этого добавляли 2 мл раствора 4 (37% HCl 3.87 ml, ТХУ 6г, FeCl3*6H2O16.65 г, вода до 500 мл), центрифугировали (10 мин, 10000g) иизмеряли поглощение приA550 на спектрофотометре (BioRad, США).Активность глутаминсинтетазы (мкмоль/мин*мг хлорофилла) вычисляли поформуле (Shapiro и Stadtman, 1970):Активность GS =A540/(0,32*Хл*t),где A540 – длинаволны,Хл – количество хлорофилла (мг),t – время инкубации (мин)2.11.
Определение внутриклеточного содержания свободного аргининаВнутриклеточный аргинин экстрагировался водой в течение 20 мин при95°C и анализировался в супернатанте после центрифугирования (12000g, 5 мин).Общее количество свободно аргинина измеряли по описанной ранее методике(Sakaguchi, 1950). 100 мкл 0,2% 8-гидроксихинолина и 100 мкл 2M NaOHдобавляли к супернатанту, затем реакционную смесь инкубировали 10 минут нальду. После добавления 100 мкл 19% гипохлорита натрия и перемешивания навортексе в течение 30 с реакцию останавливали добавлением 100 мкл 40%мочевины. Абсорбцию измеряли при длине волны 500 нм. Количество аргинина47определяли по калибровочной кривой, построенной с использованием водныхрастворов чистого аргинина (Sigma, США) в диапазоне концентраций 10-200мкг/мл.2.12. Определение содержания глутамата в средеИспользованный энзиматический метод определения глутамата в средеоснован на изменении поглощения при длине волны 340 нм в результатевосстановления НАД+ до НАДН в ходе дегидрогеназной реакции окисленияглутамата.Вэкспериментахиспользовалсянабордляопределенияглутамина/глутамата согласно рекомендациям производителя (Sigma, США).Клетки, выращенные на среде с 10 mM глутамина, в экспоненциальной истационарной фазах роста центрифугировали, а полученный супернатантиспользовали для измерения содержания глутамата.
В качестве контроляиспользовалась свежая среда с 10 мМ глутамина.2.13. Клонирование, экспрессия и очистка рекомбинантных белковРекомбинантные белки PII Chlorella variabilis (CvPII), Physcomitrella patens(PpPII), Oryza sativa (OsPII) были получены с использованием синтетическихгенов с оптимизированным наборомкодонов для экспрессиив E.coli(Geneart/LifeTechnologies, Германия; MWG Eurofins GmbH, Германия).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
