Диссертация (1145822), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Этотразмер соответствует банду в 22 кДa, выявленному при иммунодетекции (рисунок17). Анализ полученной последовательности белка CvPII, представленной нарисунке 19, c использованием программного обеспечения ChloroP 1.1 и TargetP1.1позволилвыявитьпотенциальныйсигнальныйпептид,определяющийхлоропластную локализацию и состоящий из 47 аминокислотных оснований(Emanuelsson et al., 1999; Emanuelsson et al., 2007). Расчетная молекулярная массазрелогоCvPII,состоящегоиз162аминокислот,составляет17.1кДа.Действительно, в общем клеточном экстракте растворимых белков, помимонепроцессированной формы белка, иммунологическитакже была выявленавторая полоса, соответствующая белку этого размера (рисунок 17).
Эти данныеуказывают на то, что аналогично C. reinhardtii, белок CvPII вероятнее всеголокализован в хлоропласте.67Рисунок 19. Структура кодирующей последовательности гена GLB1 и соответствующаяаминокислотная последовательность CvPII C. variabilis.А Схема экзон-интронной структуры CvGLB1. Черными прямоугольниками обозначеныэкзоны, а линиям соответствуют области интронов. ATG – старт-кодон, TAG – стоп-кодон.Белыми треугольниками обозначены сайты рестрикции TaqI. Пары ПЦР-праймеров обозначенычерными стрелками.
В нижней части представлена фотография фрагментов в агарозном гелепосле ПЦР на матрице кДНК C. variabilis. GLB1R3 сконструирован для участка экзон1-экзон2.Б Полная аминокислотная последовательность CvPII.3.2.4. Транскрипция гена CvGLB1, кодирующего белок CvPIIРост NC64A на разных источниках азота. Ранее былапоказана PII-зависимая регуляция транспорта нитрата/нитрита для цианобактерий и A.
thaliana(см. гл. 1) (Forchhammer, 2010; Ferrario-Merry et al., 2005; Ferrario-Merry et al.,2008). В отличие от многих цианобактерий, водорослей и высших растений,NC64A не растет на нитрате или нитрите (Kamako et al., 2005). Кроме того, вотличие от C. reinhardtii, для которой предпочтительным источником азотавыступает аммоний, С.
variabilis NC64A демонстрирует значительно более низкиеуровни роста (максимальные концентрации клеток) на среде с аммонием вкачестве единственного источника азота, чем в среде MBBM, содержащейбактопептон в качестве источника азота (рисунок 20). Стоит отметить, что встационарной фазе рост сопровождается снижением содержания хлорофилла68(рисунок 20). Эти значения согласуются с данными, опубликованными ранее(Kamako et al., 2005).Рисунок 20.
Рост C. variabilis NC64A на разных источниках азота.А Кривые роста. Число клеток (кривые) и содержание хлорофилла (столбцы) анализировалосьна протяжении 10 суток на среде MBBM (черные символы) и среде с 10 мМ аргинина (белыесимволы). В инсерции представлены кривые роста на среде с 25 мM NH4+ (серые символы).Б Время удвоения C.
variabilis на разных источниках азота.Кроме того, L-аргинин также может использоваться клетками С. variabilisNC64A в качестве единственного источника азота (McAuley, 1986). Согласнополученным данным этот штамм демонстрирует наиболее высокую скоростьроста и достигает максимальной концентрации клеток при 10 мМ аргинина всреде (рисунок 20Б). При росте на данном источнике азота NC64A достигаетстационарной фазы при концентрации ~ 2 × 107 клеток на мл (рисунок 20A).Причем не было выявлено достоверных отличий в параметрах роста привыращивании на среде с более высокой концентрацией аргинина (15мМ) посравнению со средой, содержащей 10 мМ аргинина (рисунок 20Б). Нами былпроведен дополнительный анализ содержания хлорофилла в клетках. Несмотря нато, что самое низкое содержание хлорофилла было зафиксировано в клетках,выращенных на MBBM, они имели наименьший средний диаметр клеток (4 μм и4.2 μм в середине экспоненциальной и стационарной фаз роста).
Промежуточныеразмеры диаметров соответствовали клеткам, выращенным на среде с аргинином(4.9 μм и 5.2 μм, соответственно). Поскольку была выявлена зависимая от азота69регуляция экспрессии PII белка у C. reinhardtii, возник вопрос о возможнойрегуляции PII-белка C. variabilis. Однако в связи с тем, что не было найденолитературных данных по экспрессии генов у C. variabilis, необходимо былопровести предварительную работу по поиску подходящего референс-гена дляколичественного анализа экспрессии.Выборреференс-генадляанализаэкспрессиигеновметодомколичественного ПЦР в режиме реального времени.
Для достоверного анализаэкспрессии необходима нормализация экспрессии генов относительно гена,транскрипция которого не изменяется в условиях проводимого эксперимента(референс-ген). Поиск по базам данных С. variabilis NC64A позволил выявитьнесколько потенциальных кандидатов на роль референс-генов, кодирующихпредполагаемые белки GPD1 (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа), EF1A(фактор элонгации 1α), АСТ (актин), MDH3 (малатдегидрогеназа), PYK(пируваткиназа), UBI (убиквитинлигаза Е2) и CBLP (рецептор активируемойпротеинкиназы С1). Для начала был проведен анализ экспрессии выбранныхпредполагаемых генов домашнего хозяйства в условиях присутствия и отсутствияразных источников азота на этапах жизненного цикла C. variabilis. Полученноераспределение уровней Ct приведено на рисунке 21.70Рисунок 21.
Распределение уровней Ct кандидатов на референс-гены в экспоненциальной(ранней, средней, поздней) и стационарной фазах роста клеток C. variabilis, выращенных наМВВМ (черный) и средах с 10 мМ аргинина (белый), с 25 мMNH4+ (светло-серый) или в средебез азота (темно-серый). рэ – кДНК из клеток в ранней экспоненциальной фазе; сэ – кДНК изклеток в средней экспоненциальной фазе; пэ – кДНК из клеток в поздней экспоненциальнойфазе; с – кДНК из клеток в стационарной фазе; -N– кДНК из клеток на среде без источникаазота.71В качестве контрольного гена необходимо было выбрать кандидата снаиболее стабильной экспрессией, т.е.
с наименьшим коэффициентом вариации(CV) и разбросом значенийне более чем в 2 раза (MFC, отношениемаксимального и минимального значения, наблюдаемого в наборе данных) (DeJonge et al., 2007). Все 7 проанализированных генов имели суммарный CV более4% (таблица 2). Таким образом, GPD1, EF1A, АСТ, MDH3, PYK, UBI и CBLP вданном случае не могут быть использованы к качестве референс-генов из-заслишком высокой степени вариабельности транскрипции при росте на разныхисточниках азота.Таблица 2.ГенСреда с аргининомMBBMСреда с аммониемСреда без азотаСрSDCVMFCСрSDCVMFCСрSDCVMFCСрSDCVMFCUBI25.880.6832.651.1127.201.3194.851.1428.290.5341.891.0627.70.7392.671.06CBLP22.751.3235.821.1623.971.2595.251.0624.940.5522.211.0824.511.1314.621.11EF1A17.451.90210.91.3420.030.5082.531.0920.680.8744.231.1318.481.1696.331.15GPD126.212.1498.201.2830.340.9943.281.1029.781.1893.991.1228.571.6675.831.15PYK24.581.7587.151.2427.930.8122.911.0827.931.2044.311.1225.651.0974.281.12MDH321.541.8768.711.2524.351.3185.411.1624.651.1234.561.1223.950.4201.761.04AKT26.201.0293.931.1129.561.0353.501.1129.010.9413.241.0928.470.8082.841.07GLB130.580.9623.141.0930.620.5971.951.0531.020.6582.121.0431.220.3441.11.02Ср – среднее Ct; CV – коэффициент вариации, равный стандартному отклонению, деленному на среднее(выражен в процентах); MFC – отношение максимального и минимального Ct по разным опытам.Анализ экспрессии CvPII в средах с разными источниками азота.Экспрессия гена CvGLB1 была проанализирована в клетках из экспоненциальной(ранней, средней и поздней) и стационарной фаз роста культур, выращенных насреде MBBM, а также на средах с аргинином и аммонием в качестве источниковазота.
Средние значения Ct в этих условиях представлены на рисунке 22А.Примечательно, что этот ген (CvGLB1) имел CV нижеиспользованныхусловиях(таблица2).Чтобыуровня 4% при всехпоказать,чтоCvGLB172экспрессируется на постоянном уровне на средах с разными источниками азота ив среде без азота, была проведена нормализация относительно генов спостоянным уровнем экспрессии в условиях эксперимента (рисунок 22Б и 22В).Рисунок 22.
Анализ экспрессии гена CvGLB1 методом ПЦР в режиме реального времени вусловиях роста на разных источниках азота. рэ – кДНК из клеток в ранней экспоненциальнойфазе; сэ – кДНК из клеток в средней экспоненциальной фазе; пэ – кДНК из клеток в позднейэкспоненциальной фазе; с – кДНК из клеток в стационарной фазе; -N – кДНК из клеток на средебез источника азота.А Вариация уровней Ct гена CvGLB1 в пробах в экспоненциальной (ранней, средней, поздней)и стационарной фазах роста на среде МВВМ (черный) и средах с 10 мМ аргинина (белый), 25мM NH4+(светло-серый) или после инкубации на среде без азота (темно-серый).Б Относительные уровни транскрипции CvGBL1 на разных стадиях роста на среде с 10 мМаргинина и МВВМ.
UBI использовался в качестве референс-гена для клеток, выращенных наМВВМ, ACT – для клеток, выращенных на среде с аргином в качестве источника азота. Уровнибелка CrPII приведены на верхней панели. Антитела против HSP70В использованы дляконтроля загрузки.В Относительные уровни транскрипции CvGLB1 на среде без азота. Клетки C. variabilisвыращивали на среде с источником азота до логарифмической фазы и переносили на среду безазота на 2 и 24 ч. Относительные уровни экспрессии нормализованы относительно экспрессиигена MDH3.
Увеличение транскрипции AMT1 использовалось в качестве позитивного контроляответа клеток на голодание по азоту.73UBIиспользовалсявкачествевнутреннегоконтролядляклеток,выращенных на MBBM, а ACT был использован для клеток, выращенных нааргинине в качестве источника азота (рисунок 22В). Было показано, что в среде саргинином относительные уровни экспрессии CvGLB1 были близки во всех типахклеток, свидетельствуя о том, что транскрипция CvGLB1 не зависит от фазы роста(рисунок 22Б).
Варьирования в уровнях белка CvPII также не было выявлено(рисунок 22Б, верхняя панель).Примечательно, что перенос из среды саргинином в среду MBBM также не приводил к изменению транскрипцииCvGLB1 или уровней белка CvPII (рисунок 22Б). Полученные нами результатыуказывают на то, что экспрессия CvGLB1 не зависит от стадии роста илиисточника азота.Поскольку голодание индуцирует транскрипцию GLB1 у С. reihardtii(рисунок14),былопроверено,неконтролируетсялииэкспрессияCvGLB1удалением азота из среды. Для этого клетки C. variabilis были выращенына среде MBBM до середины экспоненциальной фаза роста, а затем переведены всреду без азота (рисунок 22В).
Ген AMT1 (GenBank: 17352992), имеющийсходство с транспортером аммония AMT1;2 А. thaliana, индуцируется удалениемазота из среды, также как это сообщалось ранее для AMT1-генов C. reinhardtii(Ermilovaetal.,2013).УвеличениеуровнятранскрипцииAMT1 былоиспользовано в качестве положительного контроля. Полученные результатыуказывают на то, что экспрессия гена CvGLB1 не зависит от доступностиисточника азота.3.2.5. Олигомерная структура CvPIIСравнительный анализ аминокислотной последовательности белка CvPII сдругими представителями этого семейства показал, что остатки, необходимые дляформирования тримерных структур бактериальных и растительных белков PII,сохраняются и в белке C.
variabilis (рисунок 16). Для экспериментальногоподтверждения образования гомотримеров рекомбинантный белок CvPII былсинтезирован в клетках E.coli RB9060. Очищенный до электрофоретической74гомогенности зрелый рекомбинантный белок StrepCvPII-tp элюировал наэксклюзионной хроматографической колонке в виде единственного пика,соответствующего молекулярной массе 53,5 кДа (рисунок 23). Посколькурасчетная молекулярная масса мономера StrepCvPII-tp составляет 18440,03 Да, тобыло сделано заключение о тримерной структуре белка CvPII.Рисунок 23.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
