Диссертация (1145822), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Эти данныеподтверждаются тем фактом, что уровни мРНК CrGLB1 повышаются в 2-3 раза втечение 2 часов освещения выращенных в темноте вегетативных клеток (рисунок13А). Кроме того, после удаления из среды азота также происходило временноевозрастание экспрессии CrGLB1 (рисунок 14А). Хотя уровни транскрипцииCrGLB1 несколько повышаются в ответ на освещение клеток и удаление азота изсреды, не было выявлено значительных изменений уровня белка CrPII (рисунок12Б, 13Б, 14Б).Предпринятые нами попытки выявить регуляцию синтеза белка PII у C.variabilis на уровне транскрипции/трансляции не привели к положительнымрезультатам.
Поскольку экспрессия генов ранее не изучалась у Chlorella, былапроведена предварительная работа по выбору референс-гена. В качествекандидатов на роль нормализатора, имеющего постоянные уровни экспрессии вусловиях эксперимента, были выбраны гены предполагаемых белков GPD1(глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа), EF1A (фактор элонгации 1α), АСТ(актин),MDH3(малатдегидрогеназа),PYK(пируваткиназа),UBI(убиквитинлигаза Е2) и CBLP (рецептор активируемой протеинкиназы С1).Экспрессия этих генов была пронализирована у клеток, выращенных на разныхисточниках азота и в среде без азота (рисунок 21). Полученные результатыпозволили прийти к заключению, что некоторые из этих генов можноиспользовать в качестве нормализаторов только для данных конкретных условий,тогда как ни один из вышеперечисленных генов не демонстрировал относительностабильной экспрессии при росте на разных источниках азота.
Однако былопоказано, что транскрипция именно CvGLB1 не изменяется при росте наразличных источникахазота и не зависит от фазы роста (таблица 2). Этирезультаты позволили предложить CvGLB1 в качестве референс-гена длядальнейшего изучения экспрессии генов метаболизма азота у C. variabilis NC64A.Среди PII-белков бактерий широко распространена регуляция путемпосттрансляционных модификаций (рисунок 2). У протеобактерий белок PII96подвергается уридилированию по остатку Tyr-51 (Magasanik, 1993), который вбелках CrPII и CvPII заменен на фенилаланин. Это указывает на то, чтопредставители этого семейства у одноклеточных зеленых водорослей не могутмодифицироваться путем уридилирования. Следует отметить, что несмотря нато,чтопоследовательностицианобактериальныхбелковсодержатPIIконсервативный остаток Tyr-51 в этой области, они не подвергаются ковалентноймодификации путем уридилирования.
Вместо этого, для PII цианобактерийхарактернопосттрансляционноефосфорилированиепоостаткуSer-49(Forchhammer и Tandeau de Marsac, 1994). Белки PII растений также содержатконсервативный, но нефосфорилируемый Ser-49, тогда как в последовательностиCrPIIэтоместопоследовательностьзанятонеостаткомисключаеттреонина.Такаявозможностиаминокислотнаяпосттрансляционноймодификации путем фосфорилирования. Однако в работе коллег было показано,чтобелокCrPIIтакженефосфорилируется(Ermilovaetal.,2013).Посттрансляционные модификации бактериальных белков PII, как правило,осуществляются в ответ на изменение соотношения уровней N/C.
Однако следуетотметить, что PII-белки зеленых водорослей и большинства высших растенийприобрели уникальную способность непосредственно связывать глутамин,который в клетках многих организмов является индикатором N/C статуса клетки.4.2. N-ацетил-L-глутаматкиназы –мишени белков PII фотосинтезирующих организмовБелки PII функционируют за счет белок-белковых взаимодействий,контролируя широкий спектр мишеней в клетке, включающих ферменты,транскрипционные факторы и белки-транспортеры. У фотосинтезирующихорганизмов в процессе эволюции появилась уникальная мишень, контролируемаяPII-белками,–ключевойферментбиосинтезааргинина–N-ацетил-L-глутаматкиназа (NAGK) (см гл.
1). В геномах C. reinhardtii и C. variabilis быливыявлены гены, кодирующие белки NAGK. Биоинформационный анализ97аминокислотных последовательностей CrPII и CvPII, а также CrNAGK иCvNAGK, показал, что остатки, необходимые для формирования комплексамежду этими белками остаются консервативными у одноклеточных зеленыхводорослей (рисунок 16, 24). Анализ кинетических параметров (Km и Kcat)позволяет говорить о том, что несмотря на значительное сходство в работе обоихферментов, белок NAGK Chlorella характеризуется несколько более медленнойскоростью ферментативных превращений, но большей чувствительностью ксубстрату NAG в сравнении с NAGK Chlamydomonas.Ранее было показано, что у цианобактерий и высших растений NAGKингибируется аргинином и PII приводит к ослаблению этого ингибирующегодействия в зависимости от наличия азота и АТФ (Beez et al., 2009).
Нами былопоказано, что подобная регуляция характерна и для белков C. reinhardtii и C.variabilis. Однако было установлено, что значение половины максимальнойингибирующей концентрации аргинина (IC50) для белка CvNAGK оказалосьприблизительно в 10 раз выше, чем для CrNAGK. Кроме того, в данной работе сиспользованием рекомбинантных белков PII и NAGK на одноклеточных зеленыхводорослях C. reinhardtii и C. variabilis впервые было показано, что дляэффективного ослабления ингибирующего действия аргинина наNAGKнеобходим глутамин. При изучении этой уникальной особенности белков CrPII иCvPII эффективные значения для глутамина были найдены в миллимолярномдиапазоне (EC506,5 ± 1,1 мМ и 4,6 ± 2,4 мМ). Анализ комплексов PII-NAGKодноклеточных зеленых водорослей в присутствии глутамина, показал, что как иу цианобактерий и растений, PII имеет только незначительный эффект накаталитические константы NAGK в отсутствии аргинина, тогда как основнаяфункция PII проявляется в модуляции ингибирования NAGK аргинином.Зависимость способности к образованию комплекса CvPII-CvNAGK отглутамина была дополнительно подтверждена данными гель-фильтрации смесиэтих белков в присутствии или отсутствии молекул-эффекторов (рисунок 26).Было показано, что только глутамин позволяет белкам принимать нужнуюконформацию для стабильного образования комплекса.
Интересным оказался тот98факт, что ключевая молекула-эффектор, 2-ОГ, которая приводит к диссоциациикомплекса у цианобактерий, у C. variabilis и C. reinhardtii не оказывала никакоговлияния на образование PII-NAGK. Однако анализ каталитической активностикомплекса NAGK-PII одноклеточных зеленых водорослей показал, что 2-ОГ непозволяет белку PII снимать ингибирующее действие аргинина на NAGK даже вприсутствииглутамина.Причемполовинамаксимальнойингибирующейконцентрации 2-ОГ для деактивации NAGK (IC50) C.
variabilis оказалась в 5 разниже, чем для белка C. reinhardtii, что может отражать разницу физиологическихконцентраций 2-ОГ в клетках этих микроорганизмов и, как следствие, адаптациюPII-белков.В ходе дальнейших исследований были получены доказательства того, чтоглутамин может контролировать уровни аргинина в условияхin vivo.Одноклеточная зеленая водоросль C.
variabilis NC64A оказалась удобныммодельным объектом для изучения этого вопроса по причине использованияглутаминавассимиляциякачественепредпочтительногосопровождаетсяисточникавнеклеточнымазота,причемдеаминированиемегоэтойаминокислоты, как это происходит у C. reinhardtii. Согласно полученным намиданным концентрации глутамина, обеспечивающие активный рост Chlorella,близки к тем концентрациям, которые были определены как эффективные для PIIопосредованной активации CvNAGK(рисунок 32).
В условиях роста на среде с 10мМ глутамина, уровни аргинина остаются высокими (рисунок 33). Однако когдаглутамин исчерпан в стационарной фазе, внутриклеточные уровни аргининауменьшается. Подобный, но менее выраженный эффект глутамина на накоплениеаргинина наблюдался в среде с 2 мМ глутамина. Содержание аргинина вкультурах, выращенных на 2 мМ глутамина, было приблизительно в 2 раза ниже,чем в культурах, выращенных на 10 мМ глутамина (рисунок 33). Кроме того,уровни аргинина в клетках, растущих на MBBM, значительно ниже, чем когдаклетки растут на средах, содержащих глутамин. Эти результаты позволяютпредположить, что в присутствии глутамина уровни внутриклеточного аргининаувеличиваются.
Кроме того, измерения общей активности глутаминсинтетаз99показали, что значения ферментативных активностей отрицательно коррелируютс уровнем глутамина в среде (рисунок 33). Ингибирование экспрессии иактивности GS глутамином имеет физиологический смысл для Chlorella: болеенизкой активности фермента достаточно для обеспечения клеток аминокислотой вусловиях ее транспорта из среды. На сегодняшний день эти результаты являютсяпервым сообщением о том, что глутамин в среде опосредует контрольглутаминсинтетаз у фотосинтезирующих протистов. Семейство генов GS С.variabilis NC64 достаточно простое и содержит только один ген, кодирующийцитозольную форму фермента, обозначенную CvGS1, и CvGS2, кодирующийпластидный полипептид.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
