Диссертация (1145822), страница 17
Текст из файла (страница 17)
В отличие от C. reinhardtii (Chen и Silflow, 1996),аммоний не влияет на уровни экспрессии обоих CvGS C. variabilis (рисунок 34).При росте на глутамине, транскрипция CvGS1 и CvGS2 остается практическипостоянной. Добавление ингибитора глутаминсинтетаз MSX неожиданно сильноповышало индукцию обоих генов CvGS, что указывает на наличие механизмакоординацииассимиляцииглутаминасегосинтезом.Былосделанопредположение о том, что репрессия генов CvGS строго зависит от клеточныхконцентраций глутамина. Таким образом, мы установили, что поток глутамата впуть, который опосредует пул аргинина, по-видимому, регулируется уровнемглутамина через белок PII.
Только при высоких уровнях глутамина, которыеуказывают на достаточное количество азота, происходит синтез запасныхсоединений азота. По нашим данным, это первый пример глутамин-зависимойсвязи метаболизма и сигналинга у одноклеточных эукариот.Поскольку для единственного ранее изученного растения A. thaliana небыло описано выявленного нами глутамин-зависимого контроля активности PIIпри его взаимодействии с NAGK, возник вопрос о распространенностивыявленного глутамин-зависимого механизма среди других растений. Для этойцели были получены и проанализированы рекомбинантные белки PII двухфилогенетически удаленных организмов – мха Physcomitrella patens и риса Oryzasativa. Было показано, что как и PII белки зеленых водорослей, PpPII и OsPIIспособныактивироватьингибированныйаргининомAtNAGKтольков100присутствии глутамина, причем по зависимому от концентрации механизму(рисунок 36).
Эти данные указывают на то, что выявленная для одноклеточныхзеленых водорослей способность белка PII связывать глутамин широкораспространена среди растений. Исключение составляют лишь PII-белкипредставителей сем. Brassicaceae, что, как уже отмечалось, вероятно, связано снебольшой делецией в Q-петле (рисунок 35).Следует отметить, что эффективные концентрации глутамина для всехпроанализированных организмов находятся в миллимолярном диапазоне (2,5-20мM), что хорошо согласуется с литературными данными по физиологическимконцентрациям глутамина для различных видов растений, таких как табак,шпинат, ячмень (Fritz et al., 2006; Riens et al., 1991; Winter et al., 1993; Winter et al.,1994).
В связи с этим, связывание глутамина с PII может иметь регуляторноезначение для клеток, приводя к эффективной активации NAGK и снятиюингибирования аргинином. Только при высоких уровнях глутамина, которыеуказывают на достаточное количество азота, синтез запасных соединений азотабудет функционально обоснован для клетки. Селективное давление, котороепривело к глутамин-нечувствительным белкам PII сем. Brassicaceae, неизвестно,но это может указывать на наличие особенностей метаболизма азота у этогосемейства растений. Глутамин является основным репортером азотного статуса умногих бактерий (Forchhammer, 2007).
Информация о глутаминовом статусеклетки воспринимается PII-сигнальной системой через глутамин-чувствительныеферменты модификации, такие как уридилтрансфераза/деуридилаза у E.coli (Adleret al., 1975; Jiang и Ninfa, 2011). В развитии хлоропластов зеленых водорослей отцианобактериальных предков, эволюция вновь изобрела способность к детекцииглутамина через небольшое С-концевое удлинение PII-сигнальных трансдукторов.Последняя структурная черта позволяет глутамину контролировать функции PIIчерез сложную сеть межбелковых взаимодействий. Выявленный факт являетсяпримером конвергентной эволюции одного из наиболее распространенных вприроде сигнальных белков.101ЗАКЛЮЧЕНИЕАнализ структуры и функции белков из семейства PII у одноклеточныхзеленых водорослей Chlamydomonas reinhardtii и Chlorella variabilis позволилприйти к следующему заключению.Впервые для представителей одноклеточных эукариот выявлены иохарактеризованы белки из консервативного семейства сигнальных белков PII,которые демонстрируют высокую степень идентичности с белками бактерий ирастений.
Полученные результаты указывают на то, что белки CrPII и CvPII,кодируемые ядерными генами, локализованы в хлоропластах. В первичнойпоследовательности изученных белков сохраняются консервативные основания,необходимые для связывания молекул-эффекторов (АТФ, 2-ОГ) и формированиятримерных структур. Кроме того, экспериментально полученные данные такжеподтверждают,чтоPII-белкиодноклеточныхзеленыхводорослейфункционируют как тримеры.ЭкспрессиягенаCrGLB1,кодирующегоPII-белокChlamydomonas,контролируется светом и отсутствием азота в среде, что не сопровождается,однако, значительными изменениями в уровнях самого белка. Установлено также,что экспрессия CrGLB1 не контролируется регуляторами гаметогенеза. Напротив,экспрессия гена CvGLB1, как и у большинства изученных ранее геновсубсемейства glnB, не зависит от присутствия источников азота, а также неизменяется в зависимости от фазы роста.
Полученные данные позволилипредложить ген CvGLB1 в качестве референс-гена для изучения экспрессии геновChlorella.В ходе выполнения исследования нами был получен фактический материал,показывающий, что ключевой фермент биосинтеза аргинина – N-ацетил-Lглутаматкиназа (NAGK), активность которого у цианобактерий и высшихрастений контролируется PII, является также мишенью PII-белков одноклеточныхзеленых водорослей C. reinhardtii и C. variabilis. Анализ каталитическойактивности белков CrNAGK и CvNAGK позволяет говорить о сходных102ферментативных возможностях, а имеющиеся отличия, вероятнее всего,отражают особенности метаболизма Chlamydomonas и Chlorella.Полученные данные подтверждают высказанную ранее гипотезу о том, чтоPII-зависимая регуляция NAGK консервативна у организмов с оксигенным типомфотосинтеза.
Однако на примере одноклеточных зеленых водорослей впервыебыло показано, что для снятия ингибирующего действия аргинина на NAGK,белки PII фотосинтезирующих эукариот нуждаются в глутамине. НаличиеконсервативнойQ-петлинаС-концеPII-белковвысшихрастений,непринадлежащих к сем. Brassicaceae, указывает на то, что глутаминовыйсигналинг может быть общей функциональной чертой PII растений.
Для проверкиэтого предположения, нами были получены рекомбинантные белки PII для двухфилогенетически удаленных представителей– Physcomitrella patens и Oryzasativa. Показано, что оба PII-белка контролировали NAGK по глутаминзависимому механизму (рисунок 37).Рисунок 37. Схема, показывающая PII-зависимый контроль биосинтеза аргинина по глутаминзависимому и глутамин-независимому механизму.103Т.о, наши данные предполагают, что в эволюции хлоропластов зеленыхводорослей от цианобактериальных предков, появился новый механизм рецепцииглутамина с помощью небольшого С-концевого удлинения PII-сигнальныхтрансдукторов.104ВЫВОДЫ1.
Одноклеточные зеленые водоросли Chlamydomonas reinhardtii и Chlorellavariabilis содержат сигнальные белки, относящиеся к субсемейству GlnBPII-белков, которые кодируются у них единичными ядерными генамиCrGLB1 и CvGLB1; полная нуклеотидная последовательность последнегоопределена (GenBank: KJ524571) и состоит из шести интронов и семиэкзонов.2. Транскрипция CrGLB1 контролируется светом и отсутствием азота в среде ине регулируется в процессе гаметогенеза. Транскрипция CvGLB1 не зависитот условий культивирования клеток; ген предложен в качестве первогореференс-гена для проведения ПЦР в реальном времени у C.
variabilis.3. Функционально активные белки PII C. reinhardtii (CrPII) и C. variabilis(CvPII) локализованы в хлоропластах и, подобно белкам прокариот ивысших растений, образуют гомотримеры.4. N-ацетил-L-глутаматкиназа (NAGK) является мишенью для белков CrPII иCvPII,которыеформируюткомплекссгексамеромферментаиконтролируют его активность.5.
Белки CrPII и CvPII регулируют активность NAGK по глутамин-зависимомумеханизму.105БЛАГОДАРНОСТИВыражаю глубокую благодарность своему научному руководителю ЕленеВикторовне Ермиловой за неоценимую помощь на всех этапах выполненияработы.Такжевыражаюглубокуюпризнательностьстаршимнаучнымсотрудникам лаборатории адаптации микроорганизмов – Залуцкой ЖаннетеМихайловне и Лапиной Татьяне Викторовне за огромную помощь в выполненииэкспериментальной части работы.Большую благодарность выражаю сотрудникам кафедры микробиологииСанкт-Петербургского государственного университета во главе с заведующимАлександром Васильевичем Пиневичем.Искреннюю признательность выражаю проф.
Карлу Форчхаммеру иколлективу его лаборатории в Университете г. Тюбинген (Германия) завозможность выполнения части экспериментов и обсуждение полученныхрезультатов.Выражаю благодарность сотрудникам ресурсных центров «Развитиемолекулярных и клеточных технологий» и «Хромас» Санкт-Петербургскогогосудврственного университета.Искренне благодарю за оказанную помощь и ценные советы сотрудникаГНУ ВНИИ Сельхозмикробиологии Евгения Евгеньевича Андронова.В завершение благодарю свою семью за помощь, понимание и поддержку.106СПИСОК СОКРАЩЕНИЙАТФ – аденозинтрифосфатАДФ – аденозиндифосфатАМФ – аденозинмонофосфатУМФ – уридилмонофосфатНАД+ – никотинамид-адениндинуклеотид (окисленная форма)НАДН – никотинамид-адениндинуклеотид (восстановленная форма)НАДФ+ – никотинамидадениндинуклеотид-фосфат (окисленная форма)НАДФН – никотинамидадениндинуклеотид-фосфат (восстановленная форма)GS – глутаминсинтетазаFBI-GS – обратимо ингибированная глутаминсинтетазаGOGAT – глутамат-2-оксоглутарат-аминотрансферазаGS/GOGAT путь – глутаминсинтетазный/глутаматсинтетазный путьGDH – глутаматдегидрогеназный путьAT – аденилилтрансфераза2-ОГ – 2-оксоглутаратGln – глутаминBCCP – biotin carboxyl carrier proteinACCаза – ацетил-CoA карбоксилазаNAGK – N-ацетил-L-глутаматкиназаNAG – N-ацетилглутаматПААГ – полиакриламидный гелькДНК – комплиментарная ДНКCDS – кодирующая последовательность ДНКПЦР – полимеразная цепная реакцияОТ-ПЦР – полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией-N – без азотаStrepCrPII-tp – рекомбинантный белок PII С.
reinhardtii без последовательноститранзитного пептида, конъюгированный со StrepII-тагом на C-конце107StrepCvPII-tp – рекомбинантный белок PII С. variabilis без последовательноститранзитного пептида, конъюгированный со StrepII-тагом на C-концеStrepPpPII-tp – рекомбинантный белок PII P. patens без последовательноститранзитного пептида, конъюгированный со StrepII-тагом на C-концеStrepOsPII-tp – рекомбинантный белок PII O. sativa без последовательноститранзитного пептида, конъюгированный со StrepII-тагом на C-концеHis6CvNAGK-tp–последовательностирекомбинантныйтранзитногобелокпептида,variabilisбезконъюгированныйсNAGKС.полигистидиновым тагом на N-концеHis6AtNAGK-tp–последовательностирекомбинантныйтранзитногобелокпептида,thalianaбезконъюгированныйсNAGKA.полигистидиновым тагом на N-концеGPD1 – глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназаEF1A – фактор элонгации 1αАСТ – актинMDH3 – малатдегидрогеназаPYK – пируваткиназаUBI – убиквитинлигаза Е2CBLP – рецептор активируемой протеинкиназы С1CV – коэффициентом вариацииMFC – отношение максимального и минимального значения, наблюдаемого внаборе данныхMSX – метионин-DL-сульфоксиминIC50 – половина ингибирующей концентрацииEC50 – половина эффективной концентрации108СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
