Диссертация (1145822), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Однако в ходе исследования былообнаружено, что белки одноклеточных зеленых водорослей CrPII и CvPIIспособны выполнять данную функцию только в присутствии глутамина. Длядетальной количественной характеристики этого эффекта, глутамин титровался вреакции ингибирования аргинином CvNAGK-CvPII в соотношениии PII (тример)к NAGK (гексамер) равном5:1. Как показано на рисунке 28 глутамин вкомбинации с CvPII действительно может активировать ингибированныйаргинином CvNAGK, и в присутствии 15 мМ глутамина ингибирующий эффектаргинина значительно снижен.
Добавление CvPII и 15 мМ глутамина к CvNAGKповышало IC50 аргинина для CvNAGK с 1,2 ± 0,05 мМ до 4,18 ± 0,35 мМ.Поскольку наибольшая разница в активности CvNAGK в присутствии или вотсутствии CvPII с глутамином наблюдалась при 2 мМ аргинина, то именно этаконцентрация аргинина использовалась для титрования эффекта глутамина(рисунок 29). Было показано, что глутамин активировал ингибированныйаргинином CvNAGK в присутствии CvPII по концентрационно-зависимомумеханизму.Половинамаксимальнойэффективнойконцентрации(ЕС50)82глутамина для активации NAGK с помощью CvPII была определена как 6,5 ± 1,1мМ. Этот ответ сходен с зависимой от глутамина активацией CrNAGK белкомCrPII, где значение EC50 для глутамина составило 4.6 ± 2,4 мМ (Chellamuthu etal., 2014).Рисунок 29.
Эффект глутамина на способность CvPII активировать CvNAGK. Энзиматическиереакции проводились в присутствии 2 мМ аргинина.Каталитические константы комплекса CvPII-CvNAGK, определенные вприсутствии 15 мМ глутамина, указывают на то, что CvPII способен повышатьмаксимальную скорость (Kcat 44,3 ± 1,05 c-1 сравнению с 25,6 ± 4,78 c-1) реакцииингибированного арнинином NAGK и снижать Km для NAG приблизительно в20,5 раз (4,5 ± 0,52 мМ по сравнению с 92,4 ± 23,7 мМ) (рисунок 30). Этот эффектаналогичен тому, что показано для белков С.
reinhardtii, где PII имеет тольконезначительный эффект на каталитические константы NAGK в отсутствииаргинина,тогдакакосновнаяфункцияPIIпроявляетсявмодуляцииингибирования NAGK аргинином по обратной связи (Chellamuthu et al., 2014).83Рисунок 30. Активность ингибированного аргинином CvNAGK в зависимости от концентрациисубстрата NAG в присутствии и отсутствии PII.Одной из молекул-эффекторов, с которой связываются бактериальные ирастительные белки семейства PII, является 2-ОГ. У цианобактерий связывание 2ОГ препятствует взаимодействию PII с его мишенями, а у A.thaliana препятствуетPII-зависимому снятию ингибирования аргинином без диссоциации комплекса. Впоследовательности CvPII также выявлены основания, необходимые длясвязывания 2-ОГ (рисунок 16). Чтобы определить характер действия 2-ОГ навзаимодействие CvPII-CvNAGK, был проведен эксперимент, в котором PII иNAGK (в соотношении 5 PII триммеров к 1 NAGK гексамеру) инкубироваливместе в присутствии глутамина (15 мM) и аргинина (2 мM), а затем титровали свозрастающими концентрациями 2-ОГ.
Как было описано выше, аргинин вконцентрации 2мМ практически не ингибировал комплекс CvNAGK-CvPII, нооказывал значительное ингибирующее действие на свободный NAGK (рисунок30). Из рисунка 31 видно, что 2-ОГ способен снижать активность NAGK позависимому от концентрации принципу. Половина максимальной ингибирующейконцентрации для деактивации NAGK (IC50) достигается при 0,23 ± 0,019 мM 2ОГ. Эта концентрация отражает сродство CvPII к эффекторной молекуле 2-ОГ,которая, предположительно, отражает адаптацию сенсорного белка PII к84физиологически значимым концентрациям этой эффекторной молекулы. Этозначение является промежуточным между значениями, определенными дляA.thaliana AtNAGK (IC50 0,036 мM) и С. reinhardtii CrNAGK (IC50 1,2 мM) (Beezet al., 2009; Chellamuthu et al., 2014).Рисунок 31.
Эффект 2-оксоглутарата на активность CvNAGK.Рост штамма Chlorella NC64A на глутамине в качестве источника азота.Поскольку был выявлен опосредованный глутамином эффект CrPII на активностьNAGK in vitro, необходимо было проанализировать, оказывает ли влияниеметаболизируемый глутамин на клеточные уровни аргинина в естественныхусловиях. Для этого штамм C.
variabilis NC64A был выращен на среде сглутамином в качестве источника азота с определением параметров роста вданных условиях. Глутамин может служить источником углерода и азота длябольшого разнообразия микроорганизмов (Forchhammer, 2007). Некоторыештаммы Chlorella также могут использовать глутамин в качестве ключевогоисточника азота (Kato и Imamura, 2009). Исключением стал симбиотическийштамм NC64A, который не показал поглощения этой аминокислоты (McAuley,1986).
Мы предположили, что клетки NC64A могут использовать низкоаффинныйтранспортер для поглощения глутамина, который не способен поддерживать ростна 2 мМ глутамина в среде. Согласно тому, как это было описано ранее, клетки втаких условиях были бледными и неправильной формы (McAuley, 1986). Тем неменее, в присутствии 10 мМ глутамина, клетки NC64A не только восстанавливали85рост, но и демонстрировали более высокую скорость роста и клеточныеконцентрации, что указывает на то, что клетки способны быстро утилизироватьэтот источник азота (рисунок 32). Следует отметить, что не было выявленодальнейшего увеличения скорости роста после 15 мМ глутамина (рисунок 32Б).Это также было подтверждено в экспериментах по оценке содержанияхлорофилла.Рисунок 32. Рост C. variabilis NC64A на глутамине.А Кривые роста.
Число клеток (кривые) и содержание хлорофилла (столбцы) анализировалосьна протяжении 10 суток на среде MBBM (черные символы), а также в среде с 10 мМ глутамина(белые символы) и с 2 мМ глутамина (серые символы). В инсерции представлены кривые ростана среде с 25 мMNH4+.Б Время удвоения С. variabilis при росте средах с 2, 10 и 15 мМ глутамина.Далее необходимо было проверить, не дезаминируется ли глутаминвнеклеточно, а затем поступает в клетки в виде аммония, как это происходит у C.reinhardtii и многих других организмов (Muñoz-Blanco et al., 1990). В связи с тем,что клетки NC64A не способны поглощать глутамат (Kato и Imamura, 2009;McAuley, 1986), нами были проведены эксперименты по оценке внеклеточныхуровней глутамата в среде с 10 мМ глутамина.
Было показано, что рост клеток на10 мМ глутамина не сопровождался детектируемым увеличением внеклеточныхуровней глутамата в среде (данные не приведены). Эти результаты указывают нато, что именно глутамин, а не аммоний используется клетками С. variabilisNC64A. Более того, в среде с аммонием NC64A демонстрирует значительно болеенизкие параметры роста, чем в среде, содержащей глутамин (рисунок 32, вставка).86Таким образом, симбиотическая водоросль С. variabilis штамм NC64A можетиспользовать глутамин в качестве источника азота при условии его высокихконцентраций.Внутриклеточное накопление аргинина в клетках штамма NC64A при егоросте на глутамине.
После того, как была показана уникальная роль глутамина вкачестве необходимой молекулы-эффектора для работы комплекса PII-NAGKодноклеточных зеленых водорослей, возник вопрос о возможной роли глутаминапри синтезе аргинина в естественных условиях. Тот факт, что C. variabilisспособна непосредственно транспортировать глутамин из среды в клетку, безпредварительного внеклеточного деаминирования, делает эту одноклеточнуюзеленую водоросль прекрасным модельным объектом для изучения этого вопроса.Чтобы определить, сопровождаются ли изменения во внешних концентрацияхглутамина в среде какими-либо флуктуациями в содержании аргинина, общийуровень свободного аргинина измеряли клетках NC64A в экспоненциальной (вначале и в конце) и стационарной фазах роста на среде MBBM, содержащейбактопептон в качестве источника азота, а также на среде с 10 мМ или 2 мМглутамина в качестве единственного источника азота (рисунок 33).Рисунок 33. Влияние концентраций глутамина в среде на внутриклеточное содержаниеаргинина и активность GS у C.
variabilis NC64A. рэ – ранняя экспоненциальная фаза роста; пэ –поздняя экспоненциальная фаза роста; с – стационарная фаза роста.А Внутриклеточное содержание аргинина в клетках, выращенных на МВВМ, а также среде с 2и 10 мМ глутамина.Б Определение активности GS в клетках, выращенных на МВВМ, а также среде с 2 и 10 мМглутамина.87Концентрацияаргининавклетках,выращенныхнаMBBMдоэкспоненциальной фазы (~ 0,5 мкг аргинина /мкг хлорофилла) и перенесенных насреду с 10 мМ глутамина увеличилась в 5 раз в экспоненциальной фазе и в 1,8раза в стационарной фазе роста. Было предположено, что эти изменения вуровнях внутреннего аргинина могут быть результатом изменений в поглощениии ассимиляции глутамина. Чтобы это проверить, содержание аргинина такжеизмеряли в клетках, выращенных на среде с 2 мМ глутамина, когда NC64Aдемонстрирует значительно более низкую скорость роста, чем в среде,содержащей 10 мМ глутамина.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
