Диссертация (1145822), страница 10
Текст из файла (страница 10)
reinhardtii локализован в хлоропласте.3.1.2. Иммунологическая идентификация CrPIIИммунологическая идентификация СrPII проводилась с использованиемполиклональных антител к зрелому белку с С-концевой меткой StrepII (StrepCrPIItp), синтезированному в мутантном штамме E. coli RB9060 (с делецией по генуglnB) (Bueno et al., 1985). Поскольку биоинформационный анализ показалхлоропластную локализацию белка, это было проверено экспериментальнометодом Вестерн-блоттинга. Как видно из рисунка 11, белок PII C.
reinhardtiiможет быть обнаружен в белковых экстрактах, полученных как из клеток, так и изпредварительно изолированных хлоропластов.МолекулярнаяпоследовательностимассакДНКбелкаGLB1,CrPII,рассчитаннаясоставляетисходя22070,40Да.изБелоксоответствующего размера был обнаружен при анализе тотального клеточногобелка. Однако, как видно из рисунка 11, в препаратах, полученных из клеток,детектируется также вторая полоса с молекулярной массой около 18 кДа. Следуетподчеркнуть,чтовычисленнаянаосновепервичнойаминокислотнойпоследовательности молекулярная масса зрелого CrPII (без транзитного пептида)составляет 17535,13 Да.
Примечательно, что в изолированных хлоропластахмолекулярная масса белка, выявленного с помощью Вестерн-блоттинга,действительно, составляет порядка 18 кДа, что указывает на то, что белок,находящийся в хлоропласте, процессирован. Полученные данные подтверждаютлокализацию зрелого белка CrPII в хлоропласте водоросли, что хорошосогласуется как с данными биоинформационного анализа, так и с результатами полокализации соответствующих гомологов, описанных ранее у растений.ХлоропластыКлетки55Рисунок 11. Определение субклеточной локализации белка PII. В качестве контроляиспользовались антитела к белкам, локализованным в цитозоле (NAB1), хлоропласте (CGE1) имитохондриях (AOX1).3.1.3.
Транскрипция гена CrGLB1, кодирующего белок CrPIIЭкспрессия CrPII на разных этапах гаметогенеза. Ранее была показанатканеспецифичная экспрессия гена, кодирующего PII у высших растений (см. гл.1) (Uhrig et al., 2009). В связи с этим был проведен сравнительный анализ уровнейэкспрессии гена CrGLB1 методом ПЦР в режиме реального времени в клетках,находящихся на разных этапах жизненного цикла (вегетативных клетках,прегаметах и гаметах) (рисунок 12А). Уровень транскрипции гена CrGLB1 неповышается в прегаметах (22 ч в среде без азота в темноте) относительновегетативных клеток, тогда как в гаметах, полученных после освещения прегаметв течение 2х часов, выявлено некоторое увеличение (в 3-4 раза) транскрипциигена.56A100100Относительная экспрессия8Lg10000Lg1000010,0110,016420CC-124lrg6БCrPIIВКПГВКПГРисунок 12. Экспрессия CrPII в вегетативных клетках, прегаметах и гаметах штамма дикоготипа СС-124 и инсерционного мутанта lrg6.
Вегетативные клетки выращивались синхронно всреде TAP (□), а затем были перенесены в среду TAP-N на 24 часа в темноту ( ). Гаметы былиполучены в результате освещения прегамет в течение 2 часов (■).А Уровни относительной экспрессии CrGLB1. В качестве положительного контроля действиясвета и голодания по азоту использовался ген CrAMT1;1, экспрессии которого повышается вответ на действие этих факторов (вставки).Б Оценка уровней белка CrPII в вегетативных клетках, прегаметах и гаметах методом Вестернблоттинга с использованием PII-специфичных антител.Далее был поставлен вопрос: связан ли наблюдаемый световой контроль сдифференциацией вегетативных клеток в гаметы? У C. reinhardtii гаметогенезпредставляет собой двухэтапный процесс (Beck и Acker, 1992).
Он инициируетсяудалением аммония из среды, что приводит к формированию в темноте прегамет(незрелых гамет), которые не способны к формированию пары с гаметамипротивоположноготипаспаривания.Длязавершенияпрограммыдифференцировки прегамет в гаметы необходимо действие второго сигнала –света. Чтобы разграничить гаметогенез и потенциально-возможное действие светабыл использован инсерционный мутант lrg6, демонстрирующий гаметогенез57(Dame et al., 2002) и теряющий хемотаксис в отсутствие светового сигнала(Ermilova et al., 2006). Характер экспрессии гена CrGLB1 у мутанта lrg6определялся методом ПЦР в режиме реального времени в вегетативных клетках идвух типах гамет: «темновых» и полученных после освещения последних втечение 2 ч (рисунок 12А).
Интересно, что уровень экспрессии этого гена умутанта lrg6 увеличивался только после освещения, тогда как для «темновыхгамет» оставался неизменным. Т.о., повышение уровней мРНК CrGLB1 послеосвещения прегамет в течение 2 часов в клетках дикого типа, а такжеинсерционного мутанта lrg6, указывает на то, что эти изменения не связаны спроцессом гаметогенеза.Методом Вестерн-блоттинга были проанализированы уровни белка CrPII ввегетативных клетках, прегаметах и гаметах обоих штаммов (рисунок 12Б).Дополнительного увеличения уровней этого белка в гаметах выявлено не было, аповышение уровней экспрессии за счет интенсификации транскрипции в 3 раза(рисунок 12Б) остается за пределами разрешения данного метода.Регуляция экспрессииCrPII светом. Для более детального анализасветового контроля уровней транскрипции гена CrGLB1 клетки C.
reinhardtiiвыращивались на среде ТАР в темноте в течение 72 часов, а затем подвергалисьосвещению белым светом в течение 30 мин, 2, 4, 6, 8 и 24 ч (рисунок 13А). Былоустановлено, что уровень транскрипции гена CrGLB1 повышается в течение 2часов освещения, достигая трехкратного увеличения, по сравнению с клетками,выращеннымивтемноте.Придальнейшем освещенииклетокуровеньтранскрипции этого гена снижается.
Методом Вестерн-блоттинга было показано,что наблюдаемое увеличение не оказывает значительного воздействия на уровнибелка PII (рисунок 13Б).В соответствии с полученными данными, можно заключить, что уровнитранскрипции и трансляции CrPII достаточно постоянны на свету и в темноте, заисключением небольшого повышения транскрипции, наблюдаемого в ответ напереноc клеток из темноты на свет.58Относительная экспрессияAБ8642000.5246ТемнотаСвет, чТемнотаСвет, ч00.524688242424CrPIIРисунок 13. Экспрессия CrPII в темноте и после освещения белым светом. Выращенные втемноте вегетативные клетки штамма СС-124 освещались в течение 0,5; 2; 4; 6; 8 и 24 ч.А Уровни относительной экспрессии CrGLB1.Б Оценка уровней белка CrPII методом Вестерн-блоттинга с использованием PII-специфичныхантител.Экспрессия CrPII в условиях недостатка азота. Поскольку быловыявленоповышениеуровнятранскрипцииCrGLB1впрегаметах,инкубированных в течение 4 часов в темноте (данные не приведены), далее намибыла проанализирована роль азота в регуляции накопления мРНК CrGLB1.Транскрипция CrGLB индуцируется уже после 30 минут удаления аммония изсреды и достигает максимальных уровней в течение 2-4 часов инкубации в средебез азота в темноте (рисунок 14А).Ранее было показано, что синхронно растущие вегетативные клеткидифференцируются в прегаметы в среде без азота в темноте только за 4 часа(Ermilova et al., 2004).
Т.о., увеличение уровня мРНК CrGLB1 в прегаметах посравнению с вегетативными клетками является реакцией именно на удалениеазота. Эти данные дополнительно подтверждают заключение о независимостирегуляции CrGLB1от гаметогенеза. Что касается уровней белка PII, то в данном59эксперименте также не было выявлено значительных различий при перенесенииклеток в среду без азота (рисунок 14Б).Относительная экспрессияA10864200Б0.524TAPTAP-N, чTAPTAP-N, ч00.524CrPIIРисунок 14. Экспрессия CrPII в вегетативных клетках в условиях недостатка азота.Выращенные в темноте вегетативные клетки штамма СС-124 переносились из полной среды(TAP) в среду без азота (TAP-N).А Уровни относительной экспрессии CrGLB1.Б Оценка уровней белка CrPII методом Вестерн-блоттинга с использованием PII-специфичныхантител.3.1.4. Олигомерная структура CrPIIСигнальныепредставляютбелкисобойPIIувсех(гомо)тримерныепроанализированныхбелки.организмовСравнительныйанализаминокислотных последовательностей демонстрирует, что все необходимые дляобразования тримерной структуры консервативные основания, характерные дляPII-белков бактерий и растений, также присутствуют в белке C.
reinhardtii(рисунок 10). Чтобы экспериментально подтвердить формирование тримерныхструктур белка CrPII, соответствующий рекомбинантный белок (StrepCrPII-tp),очищенный до уровня электрофоретической гомогенности. По данным гельфильтрации размер белка составляет около 49 кДа (рисунок 15). Поскольку вденатурирующем SDS-ПААГ белок мигрирует с молекулярной массой порядка 17кДа, был сделан вывод о тримерной структуре белка CrPII.60Рисунок 15. Анализ олигомерной структуры белка СrPII методом эксклюзионнойхроматографии (гель-фильтрации). mAU – уровень сигнала УФ-детектора при длине волны 280нм; Ve/Vo – объем элюции.А Стандартная калибровочная кривая по белкам с известными молекулярными массами.Б Профиль элюции CrPII.3.2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
