Диссертация (1145822), страница 6
Текст из файла (страница 6)
mediterranei подвергается посттрансляционноймодификации путем уридилирования (Pedro-Roig et al., 2013а). Кроме того, in vitroна рекомбинантных белках было показано прямое взаимодействие обоих белковGlnK с GS, что приводило к возрастанию активности GS в присутствии 2-ОГ(Pedro-Roig et al., 2013б). Эти данные предполагают, что археи, как и бактерии,ассимилируют аммоний по энергетически затратному пути GS-GOGAT только вусловиях недостатка азота. В связи с тем, что PII-белки у архей изучаютсяотносительно недавно, остается много белых пятен в понимании деталеймеханизмов регуляции. Однако уже сегодня полученные экспериментальныеданные указывают на высокую степень консервативности отдельных элементовPII-опосредованной регуляции у прокариот.1.4.
PII эукариотВысшие растения. Координация процессов метаболизма азота и углерода увысших растений особенно сложна в связи с многоклеточным строением этихорганизмов и тканевой специализацией. Азот, поглощаемый корнями в форменитрата, должен быть тут же восстановлен до нитрита и либо использоваться вкорневом метаболизме азота, либо транспортироваться в фотосинтетическиеткани для включения в состав аминокислот. Напротив, углерод фиксируется извоздуха в процессе фотосинтеза и в виде соответствующих предшественниковтакже включается в процессы ассимиляции азота и биосинтеза аминокислот, либо31транспортируется в корни в форме сахаров для обеспечения там достаточногоколичества энергии и углеродных скелетов органических молекул.
Столь сложнаясистемадолжнаиметьсложныймногоступенчатыйконтроль.Дляпрокариотических организмов уже достаточно давно было показано, чтоключевая роль в координации процессов метаболизма азота и углеродапринадлежит сигнальному белку PII. Несмотря на то, что этот белок былдостаточно хорошо охарактеризован у бактерий, для растений он оставался неидентифицированным вплоть до 1998 года (Hsieh et al., 1998). И до сих порнемногочисленные данные касаются, в основном, двух представителей –Arabidopsis thaliana и Oryza sativa (Sugiyama et al., 2004).Как и у цианобактерий, в геноме растений обнаружен единственныйпредставитель семейства PII-белков - GlnB-гомолог (GLB1) (Sant’Anna et al.,2009; Osanai и Tanaka, 2007).
Была показана высокая степень идентичности сцианобактериальными представителями семейства (50-54%). Молекулярная массамономера составляет порядка 15 кДа, гомотримера – 45 кДа (Mizuno et al., 2007).У растений и одноклеточных водорослей этот белок закодирован в ядре, но имеетхлоропластную локализацию (Hsieh et al., 1998; Uhrig et al., 2009). N-концеваяпоследовательность кодирует транзитный пептид хлоропластной локализации,который отрезается у зрелого белка. Кроме того, у растений и зеленых водорослейбыли обнаружены уникальные N- и С-концевые последовательности, ненайденные в соответствующих белках других организмов (рисунок 9).
Хотяфункции этих участков до сих пор не ясны, высокая консервативностьпоследовательностей и их поверхностная локализация вблизи сайта связыванияАТФ, предполагает возможную роль в сигнальных взаимодействиях с другимибелками (Uhrig et al., 2009).32АхлТПППN-концевая Консервативный участоквставкаБС-концеваявставкаВысшие растения и зеленые водорослиПрокариоты и красные водорослиРисунок 9.
Белок PII высших растений. (По: Uhrig et al., 2009; Smith et al., 2003).A Схематическая диаграмма доменной организации белка PIIу прокариотических иэукариотических организмов: центральный участок (желтый) и Т-петля (розовый) высококонсервативны у всех организмов, тогда как хлоропластный транзитный пептид (хлТП,зеленый) и N- и C-концевые вставки (синий и красный, соответственно) уникальны для высшихрастений и зеленых водорослей.
Ser-49 и Tyr-51, локализованные в консервативном участке Тпетли, подвергаются фосфорилированию и уридилированию, соответственно, у цианобактерийи ряда протеобактерий.Б Схематическое изображение вторичной структуры мономера белка PII у Arabidopsis thaliana.Последовательность Т-петли растительного белка содержит от 5 до 14аминокислот, уникальных и характерных для PII цианобактерий.
Примечательно,что в области Т-петли содержится высоко гомологичный, характерный дляцианобактерий сайт фосфорилирования (Ser-49 у Synechocystis/Synechococcus иSer-60 у Arabidopsis thaliana), а сайт уридилирования Tyr-51 (E. coli) замещенфенилаланином.Однакопроведенныеэкспериментынеподтвердилипредположение о фосфорилировании растительного PII-белка по Ser-60 в Т-петле(Smith et al., 2004). Авторы предположили, что необходимые условия не былидостигнуты в экспериментах. Однако также возможно, что эволюционно растенияутратили клеточную машину, необходимую для фосфорилирования PII (PIIкиназа/PphAфосфатаза).Как и прокариотические белки, PII Arabidopsis thaliana способен связыватьс высоким сродством АТФ/АДФ и 2-ОГ, что указывает на участие этого белка в33контроле энергетического и углеродного статуса пластид (Beez et al., 2009; Chenet al., 2006).
Однако, несмотря на достаточно широкий спектр мишенейпрокариотическихдоPII-белков,идентифицированноймишеньюунедавнегорастенийвремениоставаласьединственнойNAGK.Какицианобактериальный гомолог этого белка, NAGK Arabidopsis осуществляетпревращение N-ацетилглутамата (NAG) в N-ацетилглутамилфосфат, что являетсяключевым этапом биосинтеза аргинина, а последний в свою очередь способенобратимоингибироватьрастительнымNAGKNAGK.такжеСвязываниеприводитксигнальноговысвобождениюбелкаPIIферментасотингибирования аргинином. Наряду с высокой консервативностью механизмаэтого контроля и структуры комплекса PII-NAGK у цианобактерий и Arabidopsis,имеется ряд различий (Beez et al., 2009).
На уровне ферментативной активностиразница выявляется в способности PII активировать ингибированный аргининомNAGK. По литературным данным уровень активности A. thaliana NAGK(AtNAGK) умеренно возрастает при формировании комплекса с PII (30%увеличение Vmax и не выявлен эффект на Km) (Chen et al., 2006), тогда как дляфермента S.elongatus была показана значительная активация при связывании с PII,сопровождающаяся ростом Vmax и снижением Km (Maheswaran et al., 2004;Maheswaran et al., 2006).
Степень ингибирования аргинином также значительноотличается для этих двух белков: SeNAGK приблизительно в 50 раз болеечувствителен к аргинину, чем AtNAGK. Более того, были предположеныструктурные основы этой разницы чувствительности к аргинину (Beez et al.,2009).НеконсервативныйпептиднаС-концеSeNAGKпредставляетсянегативным детерминантом активности NAGK и взаимодействия с PII.Предположительно, он снижает каталитическую активность свободного NAGK иувеличивает ингибирующий эффект аргинина, хотя детали данного механизмаеще предстоит выяснить. Несмотря на выявленную разницу в чувствительности каргинину, для обоих белков при связывании с PII характерна сходная динамикавысвобождения NAGK от ингибирования аргинином. Было также показано, чтоАДФ приводит к диссоциации комплекса SeNAGK-PII, тогда как не выявлено34подобного эффекта для AtNAGK-PII.
В обоих системах 2-ОГ делает комплекс PIINAGK доступным для ингибирования аргинином, хотя механизм его действияотличается в деталях (Beez et al., 2009). Цианобактериальная системапредставляется более простой в этом отношении, где снижение активности NAGKопосредовано диссоциацией комплекса с PII под действием 2-ОГ.
Тогда как уArabidopsis ингибирующее активность действие 2-ОГ не сопровождалосьдиссоциацией комплекса PII-NAGK, в связи с чем был предположен болеесложный механизм действия 2-ОГ (Beez et al., 2009). Относительно низкихконцентраций 2-ОГ может быть достаточно для конформационных изменений PII,которые не позволяют снимать ингибирование NAGK аргинином, но полнойдиссоциации комплекса при этом не происходит. Несмотря на некоторые важныеразличия в деталях, обращает внимание поразительная консервативностьвзаимодействия PII-NAGK между различными доменами жизни, на чтодополнительноуказываютполученныеinvitroданныепочастичнойвзаимозаменяемости белков Synechococcus и Arabidopsis (Beez et al., 2009).Несколько лет назад в литературе появились сообщения о взаимодействииPII Arabidopsis с BCC-белками, которые подобно бактериальным BCCP, являютсякомпонентами пластидного АССазного комплекса (Feria Bourrellier et al., 2010).Эти белки выявлялись в связи с PII только в присутствии Mg-АТФ испецифическиэлюировалисьбуферомс2-ОГ.Вэкспериментахсрекомбинантным белком PII Arabidopsis in vitro было показано ингибирующеедействие на активность хлоропластной АССазы в присутствии АТФ, котороеполностью снималось в присутствии 2-ОГ, пирувата или оксалоацетата.
Былопродемонстрировано, что PII снижает максимальную скорость АССазной реакциибез изменения Km для ацетил-СоА (Feria Bourrellier et al., 2010).Что касается регуляции самого белка PII у растений, были показаныфлуктуации в уровнях мРНК при различных условиях освещения, что указываетна возможную регуляцию на уровне транскрипции (Jiang и Ninfa, 2007; Uhrig etal., 2009). Кроме того, на уровни мРНК помимо светового режима также35оказывали влияние уровни сахаров (увеличение экспрессии) и аминокислот(снижение экспрессии) в клетке.В недавних исследованиях было выявлено участие PII в регуляциипоглощения NO2- хлоропластами у A. thaliana (Ferrario-Mery et al., 2008).
Сходныеданные были получены для цианобактерий, где было обнаружено, что PIIконтролирует транспортер NO2- /NO3-. Однако у эукариотических фототрофовгомолога транспортера обнаружено не было. Регуляторные эффекты PII напоглощение хлоропластами NO2- зависят как от метаболического, так иэнергетического статуса клетки (Ferrario-Mery et al., 2008).Также для A. thaliana была показана тканеспецифическая экспрессия PII.Хотя только минорные изменения наблюдаются в уровнях транскрипции PIIразвивающихся листьев, значительное 10-кратное повышение транскрипции былозафиксировано на ранних и средних стадиях развития семян.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
