Диссертация (1145822), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Сравнительный анализ последовательностейбелков GlnB разных цианобактерий и их гомологов у других бактерий привел кидентификации 14 уникальных и характерных для всех цианобактерийаминокислот (Palinska et al., 2002). Интересно то, что большая их часть находитсявобластиТ-петли,отвечающейзафункциональныевзаимодействияиконформационные изменения молекулы белка.При недостатке азота в среде белок PII цианобактерий подвергаетсяковалентной модификации путем фосфорилирования (а не уридилирования) поостатку Ser-49, располагающемуся в том же участке Т-петли, что и Tyr-51 E.
сoli(Forchhammer et al., 1994). В последовательностях GlnB и GlnK протеобактерийположение, соответствующее Ser-49, занято аланином. Тримерный белок GlnB19цианобактерийможетприсутствоватьвчетырехразличныхформах–немодифицированной или три модифицированных (с одной, двумя или тремяфосфорилированными субъединицами). Эти формы отличаются по своейэлектрофоретической подвижности и выявляются при иммуноблоттинге внеденатурирующем ПААГ (Forchhammer и Tandeau de Marsac, 1994).Белок PII S.
elongatus, как и другие бактериальные PII-белки, строгореагирует на азотный статус клетки. В растущих на богатой аммонием средеклетках белок практически полностью дефосфорилирован, тогда как при росте нанитрате в качестве источника азота фосфорилирование PII возрастает допромежуточных уровней. В условиях голодания по азоту этот белок максимальнофосфорилируется (Forchhammer и Tandeau de Marsac, 1994; Forchhammer иTandeau de Marsac, 1995).
Однако, по-видимому, фосфорилирование PII отвечаетне на конкретный источник азота, а скорее на его ассимиляцию черезглутаминсинтазный/глутаматсинтетазный путь (GS/GOGAT). Ингибированиеодного из ферментов этого пути ведет к резкому повышению фосфорилирования,даже в присутствии аммония (Irmler et al., 1997), что предполагает участиеметаболитовэтогопутивфосфорилированииибелкаPII.Invivo нафосфорилирование/дефосфорилирование PII оказывает влияние не толькоазотный статус клетки. Было показано, что помимо добавления аммония,вызывающего дефосфорилирование PII, сходный эффект может быть достигнутпутем ингибирования фиксации или ограничения притокаСO2 к клеткам(Forchhammer и Tandeau de Marsac, 1995; Irmler et al., 1997).
Различные условияосвещения и перемещение клеток из темноты на свет также оказывают влияние насостояние фосфорилирования PII. Однако считается, что эти эффекты вторичныпо отношению к условиями азотного статуса (Forchhammer и и Tandeau de Marsac,1994). Для Synechocystis sp. PCC 6803 также было показано, что белок GlnB можетотвечатьнасостояниевосстановленностифотосинтетическойэлектрон-транспортной цепи (Hisbergues et al., 1999).Фосфорилирование PII может осуществляться только в присутствии 2-ОГ иАТФ.
Фосфатазная активность, стимулируемая Mg2+, напротив, ингибируется20АТФ и 2-ОГ (Irmler et al., 1997). Киназная и фосфатазная активности могут бытьразделеныметодомгель-фильтрационнойхроматографии.Несмотрянамногочисленные попытки до сих пор не удалось идентифицировать основукиназной активности.
Экспериментальные данные указывают на то, чтофосфорилирование осуществляют либо многочисленные взаимозаменяемыекиназы, либо какая-то уникальная, до сих пор не идентифицированная киназа.Фосфатаза же демонстрирует биохимические свойства, типичные для белковыхфосфатаз семейства 2С (PP2C) (Irmler et al., 1997).ВозможностиРIIS.еlongatesвзаимодействоватьсэффекторнымимолекулами во многом сходны с таковыми у GlnB E. coli, хотя очевиднынекоторые различия, которые могут иметь важные физиологические последствия(Forchhammer и Hedler, 1997; Forchhammer, 1999). Оба белка связывают АТФ и 2ОГ взаимозависимо. Отличительной особенностью цианобактериального PIIбелка является то, что АТФ и 2-ОГ не только взаимно влияют на сродствосвязывания соответствующего лиганда, но и уменьшают взаимный негативныйэффект соседних лиганд-связывающих сайтов в тримере белка (Forchhammer иHedler, 1997).Физиологические исследования показали, что PII-зависимая передачасигналов характерна для регуляции утилизации нитрата, поглощения бикарбонатаи генной экспрессии через глобальный регулятор азотного метаболизма NtcA(Forchhammer 2004).
По-видимому, регуляция утилизации нитрата с участиембелка PII осуществляется по нескольким путям, включая аммоний-зависимый(Lee et al., 2000) и световой (Kloft и Forchhammer, 2005) контроль поглощениянитрата, и, возможно, контроль активности нитратредуктазы у S. elongatus(Takatani et al., 2006). Некоторое время назад скрининг геномных библиотекпозволил обнаружить новые мишени PII-белка, такие какN-ацетил-L-глутаматкиназа (NAGK) (Heinrich et al., 2004; Burillo et al., 2004) и малый белокPipX (Burillo et al., 2004; Espinosa et al., 2006) у S.
elongatus, а такжепредполагаемый мембранный белок PamA у Synechocystis (Osanai et al., 2005).21NAGKпредставляетсобойфермент,катализирующийскорость-лимитирующую стадию биосинтеза аргинина (рисунок 4). Его активностьконтролируется образованием комплекса с PII иобратимо ингибируетсяаргинином (Maheswaran et al., 2004; Maheswaran et al., 2006; Forchhammer, 2008).Рисунок 4. Взаимодействие PII–NAGK и контроль биосинтеза аргинина у одноклеточныхцианобактрий. Пояснения в тексте. (По: Forchhammer, 2008).Вусловияхэнергетическомнедостаткаголоданииазота(высокие(высокиеуровниуровниАДФ),2-ОГ)PIIнеилиприспособенвзаимодействовать с NAGK (на рисунке слева). В этом случае NAGK остается всостоянии низкой активности ивысоко чувствителен к ингибированиюаргинином. Уровень ингибирования регулируется в соответствии с количествомнеобходимого аргинина для белкового синтеза. Кроме того, комплекс с NAGKформирует только немодифицированный белок PII S.
elongatus, тогда какфосфорилированный по Ser-49 PII неспособен взаимодействовать с NAGK(Heinrich et al., 2004). В условиях достаточного количества азота и энергии(низкие уровни 2-ОГ и АДФ) формируется комплекс PII-NAGK, повышающийкаталитическуюактивностьNAGKирезкоснижающийингибированиеаргинином (на рисунке справа). В результате уровни клеточного аргинина растут,22и он может быть использован для синтеза белков или запасания источника азота ввиде цианофицина (Maheswaran et al., 2006).Упомянутый выше белок PipX также является мишенью PII. Онпредставляетобнаруженныйсобойумалыйвсехбелокизцианобактерий.89аминокислот,НарядусPII,уникальныйониспособенвзаимодействовать с глобальным регуляторным белком NtcA (Espinosa et al.,2006; Espinosa et al., 2014; Forchhammer, 2008). Формирование комплексамономерного белка PipX с PII или NtcA зависит от присутствия 2-ОГ (рисунок 5).Сродство PII к PipX возрастает при низких уровнях 2-ОГ (высокое соотношениеазот/углерод).
Тогда как в условиях голодания по азоту (высокие уровни 2-ОГ)PipX высвобождается от PII и связывается с NtcA, что приводит к увеличениюэкспрессии NtcA-зависимых генов (Espinosa et al., 2007). Было показано, что PipXфункционирует как транскрипционный ко-активатор NtcA. На рисунке 5представлено схематическое изображение модели взаимодействия PII с PipX иNAGK в зависимости от азотного статуса клетки (Espinosa et al., 2014). Однаконедавно был получен фактический материал, указывающий на наличие NtcAнезависимогорегулонаPipX,которыйвключаетнетолькорегуляциюметаболизма азота, но и адаптацию процессов трансляции и фотосинтеза кизменениям окружающей среды (Espinosa et al., 2014).
По всей видимости, в этомслучае PipX воспринимает сигналы, отличные от 2-ОГ, что указывает намультифункциональные свойства этого белка и сложную систему регуляции.23Рисунок 5. Модель зависимого от 2-ОГ взаимодействия PipX и PII с мишенями. Пояснения втексте.
(По: Espinosa et al., 2014).Еще одна мишень PII – белок PamA Synechocystis, мембранный белок снеизвестной функцией. Его С-терминальный домен имеет высокую степеньсходства с механочувствительными каналами семейства MscS (Osanai et al., 2005).Этот домен взаимодействует с PII в зависимости от присутствия АТФ и 2-ОГ, чтоуказывает на участие PII в регуляции этого потенциального канала в условияхнедостатка азота. Также было показано возрастание экспрессии NtcA-зависимыхгенов у мутанта с делецией по гену pamA.
Этот ген включает в себяпоследовательность sigE, кодирующую альтернативный сигма-фактор, длякоторого была показана активация в условиях недостатка азота и участие вконтроле уровней транскрипции генов катаболизма сахаров (Osanai и Tanaka,2007).1.2.2. Грамположительные бактерииФирмикутные бактерии.
Одним из наиболее изученных представителейграмположительных бактерий на предмет PII-белков является Bacillus subtilis, укоторого имеется единственный ген PII (GlnK-гомолог), обладающий рядомуникальных особенностей (Wray, 1994). Mg2+ выступает антагонистом связыванияАТФ, а 2-ОГ практически не связывается с белком PII вне зависимости от24концентрации АТФ. Более того, для этого белка не характерна ковалентнаямодификация. В условиях недостатка азота глобальный регулятор TnrAактивирует экспрессию приблизительно 15 генов, продукты которых вовлечены впоглощение и утилизацию альтернативных источников азота, в том числеэкспрессию генов nrgAB, кодирующих транспортер аммония AmtB и PII-белокGlnK (рисунок 6) (Gunka и Commichau, 2012).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
