Диссертация (1145822), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Одноклеточные зеленые водоросли Chlamydomonas reinhardtii и Chlorellavariabilis имеют сигнальные белки из семейства PII, которые принадлежат ксубсемейству GlnB.2. PII-белки C. reinhardtii и C. variabilis локализованы в хлоропластах, формируютгомотримеры и контролируют фермент N-ацетил-L-глутаматкиназу (NAGK),который регулирует синтез аргинина.73. PII-белки C. reinhardtii и C. variabilis содержат дополнительный участок на Сконце, Q-петлю, с помощью которой связывают глутамин и регулируютактивность NAGK по глутамин-зависимому механизму.Апробация работы.
Материалы диссертации доложены и обсуждены наVII Съезде Общества физиологов растений России «Физиология растений –фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (НижнийНовгород, 2011),молекулярнойВсероссийскойна XV международной конференции по клеточной ибиологиинаучнойChlamydomonas(Потсдам,конференциисГермания,международным2012),научастием«Инновационные направления современной физиологии растений» (Москва,2013), на VIII Съезде ОФР России и Всероссийской научной конференции«Растения в условиях глобальных и локальных природно-климатических иантропогенных воздействий» (Петрозаводск, 2015).По теме диссертации опубликовано 4 статьи в журналах из перечня ВАК РФи цитируемых в РИНЦ, Scopus, Web of Science.Объем и структура диссертационной работы.
Диссертация изложена на123 страницах, состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственныхисследований, заключения, выводов, списка сокращений, списка литературы.Список литературы включает в себя 126 источников, в том числе 125 наиностранном языке. Диссертация иллюстрирована 2 таблицами и 37 рисунками.8ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ1.1.
Распространенность белков PII в природеСигнальные белки PII составляют одно из самых обширных семействсигнальных белков в природе. Растущий с каждым годом объем данных посеквенированию указывает на то, что представители этого семейства широкораспространены и консервативны в геномах как прокариотических, так ифототрофныхэукариотическихорганизмов.Нередкоупрокариотонипредставлены несколькими паралогами, выполняющими различающиеся функциив регуляции процессов метаболизма азота и углерода.
На сегодняшний деньвыделяют четыре субсемейства PII-белков - GlnB, GlnK, NifI и PII-NG. БелкиGlnB и GlnK представлены у многих прокариот, они сходны по структуре и ихфункциимогутчастичноперекрываться.Примечательно,чтофотосинтезирующие организмы, цианобактерии и растения имеют, как правило,одного GlnB-гомолога PII (Sant’Anna et al., 2009; Osanai и Tanaka, 2007),представленного у некоторых цианобактерий двумя паралогами (Laichoubi et al.,2011).
Для многих бактерий характерна консервативная колокализация в геномахи совместная транскрипция представителей субсемейства GlnB с генами glnA илиnadE, кодирующими глутаминситетазу (GS) и глутамин-гидролизующую синтазуНАД+ (Arconde´guy et al., 2001). В то же время GlnK-белки из семейства PIIкотранскрибируются и напрямую взаимодействуют с транспортером аммонияAmtB (Forchhammer, 2008; Sant’Anna et al., 2009; Leigh и Dodsworth, 2007). В рядеслучаев паралоги GlnK называют GlnZ (Azospirillum braziliense) или GlnJ(Rhodospirillum rubrum). Распространение белков другого субсемейства – NifI,ограничиваетсяазотфиксирующимиархеямиинекоторымианаэробнымибактериями, а их функция заключается в контроле активности динитрогеназы(Leigh и Dodsworth, 2007).
Относительно недавно биоинформационный анализпозволил выявить новое субсемействоPII-белков, названноеPII-NG, упредставителей которого отсутствуют высоко консервативные характерныепаттерны PROSITE. Примечательным является совместная локализация в геномах9генов PII-NG сгенами транспортеров тяжелых металлов, хотя достовернофункции белков PII-NG до сих пор не установлены (Sant’Anna et al., 2009).Некоторое время назад GlnB-гомологи были выявлены в геномах такиходноклеточных зеленых водорослей как Chlamydomonas reinhardtii (для которойранее сообщалось об отсутствии этого белка (Osanai и Tanaka, 2007), Micromonaspusilla, Volvox carteri, Selenastrum minutum (Uhrig et al., 2009).
Примечательно, чтоу растений и зеленых водорослей гены, кодирующие PII, находятся в ядерномгеноме, хотя сами белки локализованы в хлоропласте (Hsieh et al., 1998; Smith etal., 2004; Chen et al., 2006), тогда как у красных водорослей белки PIIзакодированы в хлоропластном геноме (Uhrig et al., 2009).Т.о., представители этого семейства сигнальных белков обнаружены во всехтрех доменах жизни – у бактерий, многих архей и в хлоропластах растений.Однако, несмотря на высокую степень гомологии, свойства и функции этихбелков могут существенно отличаться у разных организмов.1.2.
PII бактерий1.2.1. Грамотрицательные бактерииγ-Протеобактерии. Белок PII впервые обнаружен при изучении регуляцииглутаминсинтетазы (GS) у E.coli путем аденилирования/деаденилирования взависимости от доступности азота в среде (Shapiro, 1969). Впоследствииоказалось, что он является одним из наиболее консервативных белков у бактерийи играет значительную роль в регуляции метаболизма азота у разныхпредставителей.Организмы используют два основных способа ассимиляции аммония, такиекакглутаминсинтетазный/глутаматсинтетазный(GS/GOGAT)путьиглутаматдегидрогеназный (GDH). Выбор пути ассимиляции аммония зависит отего концентрации в среде (Reitzer, 2003).
Несмотря на большую энергетическуюэффективность второго пути, глутаматдегидрогеназа имеет низкое сродство каммонию (Km более 1 мМ) и, по-видимому, неэффективна в условиях недостатка10азота.Вэтихусловияхфункционируетсистемаглутаминсинтетаза/глутаматсинтетаза (GS/GOGAT) с использованием 1 М АТФна каждый моль аммония (Ермилова, 2012). Реакцию присоединения аммония куглеродному цитоскелету осуществляет фермент глутаминсинтетаза (GS), врезультате чего образуется глутамин, который далее может вступать во второйциклобразованияглутамата,катализируемыйглутамат-2-оксоглутарат-аминотрансферазой (GOGAT).Глутамат + АТФ +NH3глутамин + АДФ +РО42- (GS)Глутамин + 2-оксоглутарат + НАДФН2глутамат + НАДФ+ (GOGAT)При концентрациях аммония выше 1 мМ работает глутаматдегидрогеназа,катализирующая следующую реакцию:2-оксоглутарат + NH3 + НАДФНглутамат + НАДФ+ (GDH)Регуляция GS у бактерий осуществляется как на транскрипционном, так ина посттранскрипционном уровнях.
У энтеробактерий (E.coli) каталитическаяактивностьэтогоферментарегулируетсяпутемобратимойковалентноймодификации бифункциональным ферментом аденилилтрансферазой (AT) взависимости от доступности азота (Reitzer, 2003), а этот фермент, в свою очередь,контролируется сигнальным белком PII (Shapiro, 1969).Азотный статус клетки воспринимается уридилтрансферазой, в качествесигнала для которой служит абсолютная концентрация глутамина. Высокиеконцентрацииглутаминастимулируютгидролазнуюактивностьуридилтрансферазы, что приводит к деуридилированию PII-УМФ, в то время какнизкие концентрации глутамина стимулируют трансферазную активность этогофермента и происходит уридилирование PII.
Принято считать, что глутаминприсоединяется к единственному сайту на уридилтрансферазе, с которого онконтролирует обе активности. Таким образом, немодифицированная форма PII вклетках свидетельствует о достаточном количестве азота (низкое соотношение 2оксоглутарат/глутамин),тогдакакмодифицированнаяформа,PII-УМФ,сигнализирует о недостатке азота в клетках (высокое соотношение 2оксоглутарат/глутамин). От PII сигнал далее поступает на аденилилтрансферазу11(АТ) - фермент, регулирующий активность GS. 2-оксоглутарат (2-ОГ) в клеткахвыступает в качестве основного сигнала углерода. На тримере, формируемомсубъединицами белка PII, имеется три участка для связывания 2-ОГ, которыйвлияет на возможность взаимодействия PII с NtrB.
Сигнал от PII поступает нарегуляторный белок NtrC через киназу/фосфотазу NtrB, активируя фосфатазнуюактивность последней (Pioszak et al., 2000). Высокие концентрации 2-ОГблокируют присоединение PII к NtrB, приводя к снижению фосфатазной истимуляции киназной активности белка NtrB, в результате чего регулятор NtrCфосфорилируется и активирует транскрипцию Ntr-регулируемых генов.
Низкиеуровни 2-ОГ, напротив, стимулируют взаимодействие PII с NtrB, что ингибируеткиназную и активирует фосфатазную активность белка. Нефосфорилированныйбелок-регулятор не активирует транскрипцию соответствующего оперона.В геноме E.coli идентифицировано 2 гена, кодирующих представителейсемейства белка PII (glnB и glnK). Примечательно, что для glnB была показанаконститутивная транскрипция, а транскрипция glnK индуцируется в ответ наазотное голодание регулятором NtrC. Белки GlnB и GlnK имеют 67%-нуюидентичность аминокислотных последовательностей и сходные биохимическиеактивности. Эти белки могут образовывать гетеротримеры, свойства которых, повидимому, отличаются от свойств гомотримеров, и считается, что этот механизмиспользуется бактериальными клетками для более тонкого контроля метаболизмаазота при разных внешних условиях (van Heeswijk et al., 2000).
Так, при переносеэнтеробактерий из богатой азотом среды в бедную в клетках преобладает белокGlnB, тогда как при длительном культивировании бактерий в среде с низкимсодержанием азота – белок GlnK. Кроме того, GlnK способен связываться странспортером с высоким сродством к аммонию (AmtB) и регулировать егоактивность в зависимости от ковалентной модификации (инактивация АmtB привысокой концентрации аммония в среде) (Coutts et al., 2002; Javelle et al., 2004;Ермилова , 2012).В связи с тем, что PII энтеробактерий достаточно хорошо охарактеризованна молекулярном уровне, на примере E.coli будут рассмотрены особенности12структурной организации и общие регуляторные способности этих белков.Бактериальные PII представляют собой (гомо)тримерные белки из субъединиц смолекулярной массой порядка 12-13 кДа, характеризующиеся достаточно высококонсервативной трехмерной структурой (риcунок 1).Рисунок 1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
