Диссертация (1145739), страница 7
Текст из файла (страница 7)
После этого пробирку центрифугировали намаксимальной скорости в течение 15 минут, удаляли супернатант идобавляли 1 мл 70 % этанола. Затем пробирку центрифугировали намаксимальной скорости 5 минут и, удалив супернатант, давалиполучившемуся пеллету подсохнуть в течение 10-15 минут до полногоисчезновения запаха этанола. После этого ДНК растворяли в 50 мклводы и хранили при температуре – 20 ºC. Концентрацию ДНКопределяли при помощи нанофотометра Implen P300 покоэффициенту поглощения света с длиной волны 260 нм.Ген малой субъединицы рРНК амплифицировали сиспользованием пары концевых праймеров Thx25F — Helio1979R(Cavalier-Smith, Heyden, 2007). В некоторых случаях в качествеальтернативы один из праймеров этой пары заменяли на s14R, 3f илиRibA, разработанные в лаборатории Зоологии и Биологии животныхЖеневского университета (табл.
2). Праймеры были произведеныкомпанией Cинтол (Москва).Таблица 2. Праймеры, использованные для амплификации 18S рРНКНазваниеНаправлепраймераниеThx25FПрямойHelio1979R ОбратныйПоследовательность 5’-3’CATATGCTTGTCTCAAAGATTAAGCCACACACTTACWAGGAYTTCCTCGTTSAAGACGS14RПрямойAAGTTTCAGCCTTGCGACCA3fОбратныйAGGGTTCGATTCCGGAGRibAПрямойACCTGGTTGATCCTGCCAGT46Для проведения полимеразной цепной реакции использовалсякит фирмы Fermentas (#EP0402) В реакционную смесь дляамплификации, содержащую 67 мМ Tris - HCl (pH 8,8), 50 мM KCl и6,7 мМ MgCl2, 1 мМ меркаптоэтанола, 50 мМ NaCl, добавляли 2–50 нгтотальной геномной ДНК, по 100 пМ каждого праймера, 0,2 мМ каждогодНТФ и 1 ед.
Taq ДНК - полимеразы. Объем смеси составлял 25 мкл.Реакцию проводили в следующих условиях:1. Денатурация 2 минуты при + 95ºC2. 40 циклов амплификации:Денатурация 30 сек. при + 95ºCОтжиг 1 мин. при + 55–+ 50ºCЭлонгация 2 мин. при + 72ºC3. Итоговая элонгация 5 мин. при + 72ºCВ случае штаммов, которые исследовали в накопительныхкультурах, клетки по отдельности замораживали в ПЦР-пробирках сминимумом воды, после чего добавляли в них ПЦР-смесьвышеуказанного состава, но без ДНК.
Далее ПЦР проводилась сиспользованием той же программы, за тем исключением, что времяпервичной денатурации (п. 1) увеличивали до 5 минут.ПЦР-продукты, очищенные электрофорезом в агарозном геле илина колонке (Евроген, Clean Up Standard kit, # BC022) подвергалипрямому секвенированию или клонировали при помощи вектораpТZ57R/T (Thermo Scientific InsTAclone PCR Cloning Kit#K1213, #K1214)в бактериях Escherichia coli (штамм JM107).
Колонии бактерий,содержащие плазмиды со вставкой требуемой длины,идентифицировали при помощи ПЦР с универсальными праймерамиM13F и M13R. Очищенные плазмиды секвенировали по Сэнжеру спомощью капиллярных секвенаторов ABI Prism 310 илиABI Prism 3500 xl (Applied Biosystems, USA).47Полные последовательности реконструировали по совокупностиперекрывающихся участков, секвенированных при помощи внутреннихуниверсальных праймеров к 18S рРНК, с использованием программыChromas Pro ver. 1.7.4. Полученные последовательности выравниваливместе с другими последовательностями эукариотной малойсубъединицы рРНК, взятыми из базы данных EMBL/Genbank.Выравнивание проводили вручную при помощи программы SeaView(Gouy et al., 2010).Реконструкцию филогенетических деревьев на основе наборавыровненных последовательностей и их тестирование бутстрэпметодом проводили при помощи программ PhyML (Guindon, Gascuel,2003) и МrBayes (Huelsenbeck, Ronquist, 2001).
Использовали GTR invмодель с 4 (PhyML) или 6 (МrBayes) категориями. Тестированиетопологий (PhyML) проводили методом бутстрепа с использованием1000 реплик.Глава 3. Результаты и обсуждениеКак было указано выше, наиболее распростанёнными уцентрохелидных солнечников являются два типа покровных структур:разнообразные по форме кремниевые чешуйки или веретенообразныеорганические спикулы. Также чешуйки особого типа могутобразовываться при инцистировании.
Традиционно покровныеструктуры используются для описания и идентификации видов, а такжедля построения макросистемы центрохелид. Предложены различныесценарии эволюции этих образований. В нашей работе за счёткомплексного молекулярно-морфологического изучения клональныхкультур солнечников, мы рассматриваем различные аспектыприменимости этого признака для решения подобных задач. Былопоказано, что цистные чешуйки на определённых стадиях жизненногоцикла (после эксцистирования) могут сочтетаться с обычными48чешуйками трофической стадии, что может вызывать трудности видентификации. В то же время на остальных стадиях жизненного циклачешуйки трофозоитов могут служить надёжным критерием видовойидентификации, так как при анализе ко-специфичных штаммовсравнение ультраструткуры чешуек и молекулярно-филогенетическийанализ выявляют одни и те же совокупности.
При описании иидентификации родов центрохелид морфология покровных структуртакже не всегда может служить универсальным критерием. Так, намудалось показать, что в пределах родов Polyplacocystis и Acanthocystisсолнечники обладают или кремниевыми чешуйками или спикулами. Вроде Raphidiophrys один из описанных нами видов обладаетодновременно и спикулами и кремниевыми чешуйками, тогда какдругие описанные виды рода спикул не имеют. Наконец, семейства,выделенные на основании морфологии покровов, оказались неголофилетичны как это было показано Кавалье-Смитом и фон дерХейден (Cavalier-Smith, von der Heyden, 2007) для семействHeterophryidae и Acanthocystidae и нами в настоящей работе длясемейства Raphidiophryidae.
Пути эволюции покровных структур в двухотрядах центрохелид, вопреки традиционным взглядам в значительнойстепени параллельны и включают не только усложнение чешуек, но иутраты и упрощения покровных структур. Это делает центрохелидодной из интереснейших моделей для дальнейшего изучения явленийпараллельной эволюции.Разнообразие покровных структур центрохелидных солнечников взначительной мере остаётся недосточно изученным. На это указываетвысокий процент среди исследованных нами штаммов новых для наукивидов.
Вероятно, весьма большой процент разнообразия центрохелидещё только ждёт своего описания. Мы также сравнили штаммы болеекрупных симбиотнсодержащих и более мелких бесцветныхсолнечников, реизолировали солнечника Acanthocystis trifurca и49пересмотрели статус этого вида. Оба этих случая демонстрируют, чтонеобходимо не просто описание новых видов, а комплексный подход,включающий выделение чистых клональных культур, изучение их спомощью полного комплекса современных методов, грамотноесопоставление полученных данных с опубликованными данными посветомикроскопической морфологии, ультраструктуре и молекулярнойфилогении центрохелид. Только такой подход может привести тому,что представителей этой широко распространенной группы можнобудет надёжно идентифицровать и учитывать в самых различныхисследованиях.3.1 Изучение цистных чешуек Raineriophrys erinaceoides иRaphidiophrys heterophryoideaВ ходе нашего исследования на примере двух видов Raineriophryserinaceoides и Raphidiophrys heterophryoidea удалось показать, что впределах одной клональной культуры солнечники могут иметьразличные, существенно отличающиеся наборы чешуек (сравн.
рис. 11и рис. 13; рис. 14 и рис. 16). Это связано с тем, что уэксцистировавшихся особей в покровах некоторое время продолжаютперсистировать цистные чешуйки.После нескольких недель культивирования в чашках Петринаблюдали цисты (рис. 12А, 15А). Они имели сферическую форму, и уобоих видов диаметр цист составлял около 14 мкм (табл. 3).Поверхность цист как у одного, так и у другого вида покрыта чешуйкамитрофической стадии, формирующими внешний слой стенки цисты.
Ужепри исследовании цист на светомикроскопическом уровне удавалосьобнаружить внутреннюю цистную стенку из отдельных чешуек(рис. 12Б; 15Б).Эксцистировавшихся индивидуумов (рис. 12В, Г, Д, 15В, Г, Д)можно было наблюдать в более старых культурах и помимо цистных50чешуек, присутствующих наряду с обычными чешуйками трофическойстадии, каких-либо отличий от прочих трофозоитов выявлено не было.В случае R. heterophryoidea были получены субклоныэксцистировавшихся индивидуумов, и клетки в культурах имели толькочешуйки трофической стадии.У R.
erinaceoides наблюдали от 10 до 88 цистных чешуек наодного вышедшего из цисты индивидуума. Все чешуйки относились кодному типу – уплощённые многоугольные чешуйки. В то же времячешуйки этого типа скорее можно охарактеризовать как полиморфные.Были обнаружены треугольные (рис. 13Б), четырёхугольные (рис. 13В)и пятиугольные (рис. 13Ж) чешуйки, а во многих случаях число угловопределяется неявственно (рис. 13Д), нередко чешуйка имеет почтикруглую форму (рис. 13Е). Другое распространённое отклонение –удлинённая и/или изогнутая форма чешуек. Иногда можно наблюдатьчешуйки гантелевидной формы (рис. 13Г).Каждая чешуйка имеет вогнутую и выпуклую стороны.Поверхность вогнутой стороны гладкая, за исключением небольшогобугорка в центральной части (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
