Диссертация (1145739), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Дляболее интенсивного развития живых организмов в высевы добавлялизерно риса или пшеницы. В других случаях пробы разбавлялипитательной средой Прескотт-Джеймс + церофил 0,05 % (Prescott,James, 1955; Page, 1988). Высевы инкубировали при комнатнойтемпературе и нерегулируемом освещении, просматривая несколькораз в течение месяца под инвертированным микроскопом (NikonEclipse TS 100 и Leica DMI 3000B). Обнаруженных солнечников35высушивали на покровных стёклах для изучения в сканирующемэлектронном микроскопе с целью экспресс-идентификации.
Затемсолнечников, которые представляли интерес с точки зрения задачисследования, выделяли в клональную культуру. Клонировали,перенося клетки по одной в чашки Петри со свежей средой ПрескоттДжеймс + церофил, содержащей подросшую культуру кормовогообъекта – жгутиконосцев Bodo saltans (культура предоставленаА. П. Мыльниковым, Институт Биологии Внутренних Вод РАН). Переносклеток осуществлялся с помощью стеклянных капилляров. В случаях, вкоторых установить клональные культуры не удавалось, солнечниковизучали в накопительных культурах, где они могли жить до 6 месяцев,выдерживая 2–3 пересадки в свежую среду.
При изучении такихсолнечников обращали особое внимание на то, чтобы всеисследуемые организмы принадлежали к одному морфологическомувиду.Всего в ходе работы было высеяно 97 проб, из которых в 30 былинайдены солнечники. Из них 20 штаммов, относящихся к 17 видам и 5родам были выделены в чистую клональную культуру, два из них нанастоящий момент депонированы в Коллекции Культур Водорослей иПростейших (CCAP, Institute of Freshwater Ecology, England). Ещё 4вида были исследованы в накопительных культурах (табл. 1). Придлительном хранении штаммы содержали при +4 ºC, закрыв чашкилабораторной лентой Parafilm M (Sigma-Aldrich).Таблица 1. Изученные штаммы№НазваниеисточникКоординатыДатасборапробы1Acanthocystisоз. Игуменское,61°22'43" с.
ш.nichollsiВалаамский30°54'24" в. д.04.08.1036Siemensma etархипелаг,Roijackers, 1988Ладожское оз.,Карелия,Россия.Детрит уберега.2Acanthocystisр. Лягэдей-Яха,68°11'04" с. ш.nichollsiЯмало-65°42'23" в. д.Siemensma etНенецкий а.о.,Roijackers, 1988Россия.
Детрит22.06.12у берега.3Acanthocystisоз. Гурре,nichollsiДания. Детрит у 12°28'30" в. д.Siemensma etберега.56°02'24" с. ш.01.11Roijackers, 19884AcanthocystisГорный ручей с25°50'12'' ю. ш.nichollsiнебольшим27°24'15'' в. д.Siemensma etколичествомRoijackers, 1988зелени, в горах03.03.13Магалисберг(Magaliesberg),Grootkloof,Sterkstroom,Южная Африка.Детрит.5Acanthocystisоз. Лещовое,61°21'48'' с. ш.takahashiiВалаамский30°55'41'' в.
д.Dürschmidt,архипелаг,1987Ладожское оз.,Карелия,03.08.1037Россия.Заболоченныйберег.6Acanthocystisр. Амур,50° 15' 5" с. ш.takahashiiДальний127° 32' 51" в. д.Dürschmidt,Восток, Россия.1987Песчаный грунт08.12у берега.7Acanthocystisоз. Купальное,66°27'10'' с. ш.penardi Wailes,о. Средний,33°40'04'' в. д.1925Кандалакшский08.08.12залив Белогоморя. Детрит +вижимкасфагнума.8Acanthocystisоз. Чёрное,61°22'46'' с. ш.penardi Wailes,Валаамский30°54'27'' в. д.1925архипелаг,25.06.12Ладожское оз.,Карелия,Россия.
Донныйосадок уберега.9Acanthocystisоз. Леман,46°12'31'' с. ш.turfacea Carter,Швейцария,6°09'47'' в. д.1863детрит уберега.01.123810Acanthocystisоз. Леман,46°12'31'' с. ш.trifurca Nicholls,Швейцария,6°09'47'' в. д.1983детрит у01.12берега.11AcanthocystisБассейн в59°56'30'' с. ш.costataоранжерее30°17'46'' в.
д.Zlatogursky,ботанического2014сада СПбГУ,22.12.11СанктПетербург,Северо-западРоссии.12Acanthocystisоз. Симняховск61°22'41'' с. ш.crescentaое, Валаамский30°58'10'' в. д.Zlatogursky, 2010архипелаг,30.09.07Ладожское оз.,Карелия,Россия. Детриту берега.13AcanthocystisПруд в парке59°53'32'' с. ш.kirilliСергиевка,29°50'10'' в. д.Zlatogursky,Северо-запад2010России. Детрит06.12у берега.14Acanthocystisр. Амур,50° 15' 5" с. ш.sp. nov.
1Дальний127° 32' 51" в. д.Восток, Россия.Песчаный грунту берега.08.123915Acanthocystisоз. Леман,46°12'31'' с. ш.sp. nov. 2Швейцария.6°09'47'' в. д.01.12Детрит уберега.16Acanthocystisоз. Лещовое,61°21'44'' с. ш.sp. nov. 3Валаамский30°55'38'' в. д.20.06.12архипелаг,Ладожское оз.,Карелия,Россия. Детриту берега.17AcanthocystisРучей, о.66°17'21'' с. ш.sp. nov. 4Средний,33°40'06'' в. д.09.08.12Кандалакшскийзалив Белогоморя. Песок.18Polyplacocystisоз.61°22'08'' с.
ш.sp. nov.Никоновское,30°54'10'' в. д.26.06.12Валаамскийархипелаг,Ладожское оз.,Карелия,Россия. Детриту берега +выжимкасфагнума.19Raphidiophrysоз.61°22'39'' с. ш.sp. nov. 1Симняховское,30°58'07'' в. д.Валаамскийархипелаг,21.06.1240Ладожское оз.,Карелия,Россия.Выжимкасфагнума сосплавины.20RaphidiophrysКанава вдольintermediaгорной дороги,Penard, 1904Драконовы29°03'06'' ю. ш.05.03.1329°24'16'' в. д.горы, ЮжнаяАфрика.Детрит.21Raphidiophrysоз.61°22'08'' с.
ш.heterophryoideaНиконовское,30°54'09'' в. д.Zlatogursky,Валаамский2012архипелаг,04.08.10Ладожское оз.,Карелия,Россия.Выжимкасфагнума сосплавины увытекающей изозера канавы.22Choanocystisоз.61°22'54'' с. ш.symnaСимняховское,30°58'30'' в. д.Zlatogursky,Валаамский2014архипелаг,Ладожское оз.,Карелия,03.08.1041Россия.Выжимкасфагнума сосплавины.23Choanocystisоз. Лещовое,61°21'50'' с. ш.minimaВалаамский30°55'40'' в. д.Zlatogursky, 2010архипелаг,30.09.07Ладожское оз.,Карелия,Россия.
Детриту берега24Raineriophrysоз. Лещовое,61°21'48'' с. ш.erinaceoidesВалаамский30°55'41'' в. д.(Petersen etархипелаг,Hansen 1960)Ладожское оз.,Mikrjukov 2001Карелия,03.08.10Россия.Заболоченныйберег.Примечание. Жирным шрифтом выделены названия видов, покоторым получена полная последовательность гена 18S рРНК.Подчёркнуты названия видов, которые были выделены в чистуюклональную культуру.2.2 Световая микроскопияДля наблюдения и фотографирования солнечников в чашкахПетри использовали инвертированные микроскопы Nikon Eclipse TS100и Leica DMI 3000B, снабжённые фазово-контрастной оптикой. С ихпомощью также осуществляли отбор организмов для культивирования42и изготовления препаратов. Для детального изучения морфологиисолнечников на временных препаратах, а также для изучениявысушенных скелетных элементов на световом уровне использовалимикроскоп Leica DM2500 с камерой Nikon DS-Fi1.
Фотографированиепроизводили с использованием штатных пакетов программногообеспечения, входивших в комплект поставки фотокамер.Для приготовления препаратов скелетных элементов клеткивысушивали на покровных стёклах. В большинстве случаев, чтобыизбавиться от остатков клеточного тела, перед высушиванием клеткипомещались в 10%-ный раствор Triton X-100.
После высушиваниястёкла со скелетными элементами отмывали в дистиллированнойводе. Далее стекло вновь высушивали и изучали насветомикроскопическом уровне. Эти же препараты в дальнейшемиспользовали для изучения в сканирующем электронном микроскопе.2.3 Электронная микроскопия и энергодисперсионныйрентгеновский анализДля изучения в сканирующем электронном микроскопе покровныестёкла прикрепляли к предметным столикам с помощью проводящегоскотча и напыляли слоем платино-палладиевой смеси толщиной в 510 нм. Микроскопирование осуществляли, используя микроскопы ZeissSupra 40 VP, Zeiss Merlin и Tescan Mira3 LMU.
Дляэнергодисперсионного рентгеновского анализа (Oxford InstrumentsINCAx-act) клетки высушивали на канцелярском скотче, чтобыизбежать сигнала от кремния, содержащегося в стекле. Рентгеновскиеспектры измеряли минимум в 50 точках образца. Для сравнения такжеснимали несколько спектров в области столика, где образецотсутствует, чтобы отсечь фоновые сигналы.Для изучения в просвечивающем электронном микроскопесолнечников высушивали на медных блендах с формваровой43подложкой.
Как и при высушивании на стёклах, клетку удаляли спомощью Triton X-100, затем скелетные элементы, закреплённые наподложке, прополаскивали в дистиллированной воде и опятьвысушивали. Далее бленды просматривали на электронныхмикроскопах Jeol JEM-1400 и Jeol JEM-2100HC без дополнительногоконтрастирования.2.4 МорфометрияОсновными параметрами для измерения были диаметр клетки,длина радиальных чешуек (или спикул), длина и ширина пластинчатыхчешуек (рис. 10А, Б).
Длину радиальных чешуек с ветвями или зубцамина конце измеряли от основания до воображаемый линии,соединяющей кончики этих образований (рис. 10В). В случае изогнутыхрадиальных чешуек измеряли длину прямой, соединяющей вершину иоснование чешуйки (рис. 10Г). Измерения размеров клетки и скелетныхэлементов проводились на микрофотографиях с помощью программыImage Tool Ver. 3.0. При этом программу предварительно калибровалипо фотографиям объект-микрометра, сделанным на том же увеличениисветового микроскопа или по масштабным чертам намикрофотографиях с электронного микроскопа.
Измерение диаметраклетки проводили на живых солнечниках, не придавленных покровнымстеклом (в чашках Петри). В случае скелетных элементов приисследовании клональных культур для изготовления препаратов бралисуспензию клеток, и чешуйки от отдельных индивидуумовперемешивались. Поэтому приводится только число измеренныхскелетных элементов по каждому штамму без информации о числеисследованных особей. Полученные в Image Tool данные переносили впрограмму Excel (MS Office, 2003), c помощью которой вычислялисреднее значение и его стандартную ошибку. На выборках с n < 10какой-либо статистической обработки данных не проводили.44Рис. 10.
Основные морфометрические параметры, использованные вработе. А. Общий вид клетки. Б. Пластинчатая чешуйка. В. Радиальнаячешуйка с бифуркацией. Г. Изогнутая радиальная чешуйка. дк –диаметр клетки; дпч – длина пластинчатой чешуйки; дрч – длинарадиальной чешуйки; шпч – ширина пластинчатой чешуйки. (По:Siemensma, 1991, с изменениями).2.5 Молекулярная филогенияГеномная ДНК была изолирована из клеток с помощью гуанидинизотиоцианатного метода (Maniatis et al., 1982). Для этого клеткиотбирали стеклянным капилляром в пробирку c гуанидинтиоцианатным буфером, после чего хранили до момента экстракциипри температуре + 4ºC или сразу же переходили к экстракции.Для изоляции ДНК клетки в буфере коротко вортексировали ивыдерживали при температуре + 55ºC в течение 10 минут, после чего45для осаждения ДНК к раствору прибавляли эквивалентный объёмизопропанола. Смесь вновь вортексировали и оставляли при – 20 ºC неменее чем на полчаса.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
