Диссертация (1144820), страница 35
Текст из файла (страница 35)
Как следует, из приведенных данныхбольшинство выявленных «ридов» были картированы на геном (>64%).Поскольку большую часть картированных «ридов» представляла микроРНК(>71%),томожноутверждать,чтополученныебиблиотекибылинадлежащего качества и пригодны для дальнейшего сравнительного анализа.Необходимо отметить, что для всех трех групп образцов быливыявлены около 500 известных микроРНК с покрытием не менее 5 ридов(табл. 31).Распределение типов малых РНК, в зависимости от места локализациирида в геноме, показано на рис. 30.
Все библиотеки имели сходноераспределение типов малых РНК: более 71% составляли микроРНК, около2282299% большие промежуточные некодирующие РНК (>9,9%) и только 2,1% малые ядрышковые РНК.Таблица 31. Характеристики библиотек микроРНК (по Vashukova etal., 2016).ХарактеристикаОбщее количество ридовЧисло триммированных ридовЧисло ридов, выровненных нагеномКоличество уникальных ридов,соответствующихпредшественникам микроРНКОбщеечислоридов,соответствующих микроРНККоличествоизвестныхмикроРНК (при покрытии ≥ 5x)Контроль,n=62 241 561100 821(4,5%)1 184 799(64,2%)9 060805 102(71%)522Гестоз,n=8Гестоз,развившийся нафонегипертонии, n=52 527 9691 502 48497 58458 019 (3,9%)(3,9%)1378792 827 455 (68,6 %)(70,3%)10 7857 5761 066 960(77,3%)476606 821 (73,9%)466Анализ экспрессии генов микроРНК с помощью програмы «CAPmiRSeq», позволил установить, что в большинстве образцов контроля, иосновной группы преобладали микроРНК miR-23a-3p, miR-517a(b)-3p и miR518e-3p (см.
табл. 32). В дальнейшем было показано, что только miR-518e-3pстатистически значимо отличается по уровнию экспрессии при ГОГ (гестозе,осложненном гипертонией) по сравнению с нормой (табл. 32) (Vashukova etal., 2016).Дальнейшие эксперименты по сравнению спектров микроРНК, вворсинчатом хорионе плаценты рожениц с гестозом в целом и с гестозом,осложненным гипертонией, в сравнении с нормой позволило выявить 13микроРНК, достоверно отличающихся (p<0,01) по экспрессии генов вобразцах плацент от женщин с гестозом по сравнению с контрольнойгруппой (Vashukova et al., 2016). Однако, с учетом поправки на229230множественные сравнения (FDR<0,05), таких микроРНК выявлено не было(Vashukova et al., 2016).Рисунок 30.
Распределение продуктов экспрессии малых РНК в трехгруппах (контроль, гестоз, гестоз на фоне гипертонии) (по Vashukova et al.,2016).Примечание:miRNA – микроРНК,lincRNA – большие промежуточные некодирующие РНК,230231snoRNA – малая ядрышковая РНК,snRNA – малая ядерная РНК,rRNA – рибосомная РНК,sense_intronic – последовательность, локализованная в интроне,Mt_tRNA – митохондриальная транспортная РНК,Mt_rRNA – митохондриальная рибосомная РНК,misc_RNA – белок некодирующая РНК с неизвестной функцией,antisense – антисмысловая последовательность,processed_transcript-последовательность,соответствующаяпроцессируемому транскрипту,protein_coding – белок-кодирующая последовательность,pseudogene – последовательность псевдогена.Маркером гестоза на фоне гипертонической болезни было изменениеуровня 51 микроРНК (p<0,01), из которых 22 (табл. 33) соответствовалипоправке на множественные сравнения (FDR<0,05).
7-мь из них снижалиуровень при гестозе: miR-135b-5p, miR-195-5p, let-7f-5p, miR-34c-5p, miR-13p, miR-98-5p, miR-223-3p, а 15-ть – повышали: miR-515-3p, miR-31-5p, miR210-3p, miR-518a-3p, miR-524-3p, miR-518c-3p, miR-520a-3p, miR-515-5p,miR-516a-5p, miR-519e-5p, miR-193b-3p, miR-4532, miR-518f-3p, miR-518a5p, miR-518e-3p (см. рис. 42) (Vashukova et al., 2016).231232Таблица 32. МикроРНК, доминирующие в ворсинчатом хорионе у женщин с различными формами гестоза и вконтрольной группе.Тип (номер)библиотекиПреобладающаямикроРНКНормаГестоз, доношенныйсрокГестоз на фоне гипертоническойболезниX1405.001X1405.016X1407.013X1408.006X1408.007X1408.009X1311.005X1407.014X1407.002X1311.003X1407.015X1408.004X1408.005X1408.011miR23a3pmiR517a(b)-3pmiR517a(b)-3pmiR23a3pmiR23a3pmiR23a3pmiR518e3pmiR517a(b)-3pmiR517a(b)-3pmiR518e3pmiR23a3pmiR518e3pmiR30d5pmiR517a(b)-3p232233Таблица 33.
микроРНК, изменяющие уровень в ворсинчатом хорионеплацент у женщин с гестозом на фоне хронической гипертонии (ГОГ) посравнению с контролем (К) (FDR<0,05).ХромосомикроРНКСемейстИзменениеДостигаемыйПоправкаводифференциалуровеньпо методуьного уровнязначимости,БеньяминиэкспрессииP-value-Хохбергама(logFC)(FDR)хр19miR-515-3pmir-5151,71732,5718*10-50,0038хр1miR-135b-5pmir-135-1,34952,6775*10-50,0038хр9miR-31-5pmir-311,34973,3026*10-50,0038хр11miR-210-3pmir-2101,22593,4159*10-50,0038хр17miR-195-5pmir-15-1,46556,4634*10-50,0058хр19miR-518a-3pmir-5151,45479,1517*10-50,0061хр19miR-524-3pmir-5151,64780,00010,0061хр19miR-518c-3pmir-5151,08540,00010,0061хр19miR-520a-3pmir-5151,56910,00010,0063хр19miR-515-5pmir-5151,27050,00020,0079хр19miR-516a-5pmir-5151,46290,00020,0079хр19miR-519e-5pmir-5151,22070,00050,0150хр16miR-193b-3pmir-1931,12770,00050,0150хр9, хрХlet-7f-5plet-7-1,06300,00050,0150хр20miR-4532-1,97120,00050,0150хр19miR-518f-3pmir-5151,14460,00060,0160хр11miR-34c-5pmir-34-1,55350,00060,0164-1,26980,00100,0233хр18,mir-1хр20miR-1-3pхрХmiR-98-5plet-7-2,58480,00100,0233хр19miR-518a-5pmir-5151,07890,00130,0270хрХmiR-223-3pmir-223-0,81450,00140,0281хр19miR-518e-3pmir-5150,73560,00250,04862332343miR-223-3pmiR-98-5pmiR-1-3pmiR-34c-5plet-7f-5pmiR-195-5pmiR-518e-3pmiR-518a-5pmiR-518f-3pmiR-4532miR-193b-3pmiR-519e-5pmiR-516a-5pmiR-515-5pmiR-520a-3pmiR-518c-3pmiR-524-3pmiR-518a-3pmiR-210-3p-1miR-31-5p0miR-515-3p1miR-135b-5pLog 2 fold change2-2-3Рисунок 31.
Изменение уровня микроРНК в ворсинчатом хорионеплацент у женщин с гестозом на фоне хронической гипертонии (ГОГ) посравнению с контролем (К) (при p<0,01 и FDR<0,05).3.2.1.2.4. Исследование метилирования промоторных регионов гена H19 вплаценте при гестозе и в контроле.Имеются данные о том, что метилирование промоторного региона генаH19 может играть роль в развития гестоза (Yu et al., 2009; Gao et al., 2011).Нами исследованы два промоторных региона гена H19 тремяметодами: МЧ-ПЦР, МСП и КОБРА.
Совместное использование данныхметодов было продиктовано необходимостью исследовать внутри промоторамаксимальное число CpG сайтов, относящихся, к так называемым, DMRрегионам (дифференциально метилированным регионам).Нарис.32представленыэлектрофореграммыПЦР-продуктовплаценты от женщин с гестозом, полученные после проведения МЧ-ПЦРпервогорайонагенаH19.Каквидноизрис.32,ПЦР-продукт,соответствующий гену H19, выявлен только после обработки эндонуклеазойрестрикции Hpa II, а не MspI. Это доказывает, что все цитозины данногорегиона гена H19 метилированны.234235Рисунок32.ЭлектрофореграммаПЦР-продуктовпромоторныхрегионов генов H19 (район 1), RASSF1A и LPL после обработки ДНКрестриктазами HpaII и MspI.Оценку метилирования района 2 гена H19 проводили методом МСПЦР (см.
рис. 33). Как видно из рис. 44 ПЦР продукт, соответствующийданному району, выявлялся только при использовании m-праймеров, а не uпраймеров, что свидетельствовало о метилированным состоянии участка 2гена H19.Для оценки статуса метилирования обоих районов генаH19использовали комбинированный бисульфитно-рестрикционный анализ. Нарис. 34 приведена электрофореграмма ПЦР-продуктов промотора гена H19.Как следует из электрофореграммы, цитозиновые нуклеотиды второгорайона этого гена метилированы, а первого района представлены аллелями,различающимися по метилированию.235236Рисунок33.ЭлектрофореграммаПЦР-продуктовпромоторногорегиона генов H19 (район 2) после обработки бисульфитом натрия.Рисунок34.ЭлектрофореграммаПЦР-продуктовпромоторныхрегионов гена H19 после проведения бисульфитно-рестрикционного анализа.Таким образом, полученные результаты подтверждают данные ометилированном состоянии промоторной области гена H19 в клеткаххориона при гестозе.
Однако в связи с тем, что метилированы были не тольковсе образцы плацент женщин с гестозом, но и все образцы контрольной236237группы пациентов, полученные результаты не позволяют утверждать ововлеченности в гестоз метилирования регионов данного гена.3.2.1.3. Заключение.В проведенном исследовании были изучены как известные маркерыгестоза, так и новые.
Для этого были использованы различные стратегии, как«традиционные» (анализ частот аллелей и их комбинации), так исовременные (математические модели риска заболевания).Для некоторых ранее установленных генов-кандидатов, а именно,MTHFR,SERPINE1,AGTR2,F2,сиспользованиемклассическихстатистических подходов на нашей выборке пациентов удалось подтвердитьих роль в развитии гестоза. Построенные математические модели гестоза(как на основании метода MDR, так и метода GLM) также включали рядизвестных генов-кандидатов: APOE, AGTR2, MTHFR и F2. Важно отметить,что ни «классические подходы», ни методы математического моделированияне позволяют с уверенностью предсказать развитие гестоза у конкретнойженщины. Однако они дают достаточно оснований для формирования групприска по этой частой патологии беременности.Помимо известных генов-кандидатов, нами были впервые выявленынекоторые новые маркеры риска этой патологии.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
