Диссертация (1144820), страница 33
Текст из файла (страница 33)
Для «STRING» никаких преобразований не требовалось, тогда как для210211«ANDSystem» вместо белков в сеть были вставлены соответствующие имгены. В объединенной сети (см. рис. 27С) связанными оказались уже 63 парыгенов, что на 18 больше, чем в генной сети «ANDSystem» и на 18 больше,чем в сети «STRING» (Glotov et al., 2015a).Рисунок27.Ассоциативныемолекулярно-генетическиесетибелков/генов гестоза, СД, ожирения и гестационного диабета. Сетипостроены с помощью программ «STRING» (А) «ANDSystem» (В), и спомощью обеих программ (C).
В сети «ANDSystem» шариками показаныбелки, картинки с двойной спиралью обозначают гены. В сети «STRING»шариками показаны гены/белки (даны названия белков). Объединённая сетьпостроена c помощью «Cytoscape» (Smoot et al., 2011). Линии и стрелки вовсех трёх сетях указывают на связь между элементами. В сетях«ANDSystem» и «STRING» цвет и форма стрелок указывают на тип связи.211212Цвет линий в объединённой сети указывает на источник связи (красный –«ANDSystem», зелёный – «STRING», синий – связь присутствует в обеихсетях «ANDSystem» и «STRING») (по Glotov et al., 2015a).Применениеданногоподхода(когдаиспользуетсянесколькобиоинформатических программ) обеспечивает большую достоверностьполученных результатов и позволяет надеяться, что теоретические данныеполучат подтверждение на практике.3.2.1.2.1.4.
Анализ сверхпредставленности биологических процессов.Для поиска общих процессов, которые лежат в основе гестоза, СД,ожирения и гестационного диабета, проведен анализ сверхпредставленностибиологических процессов - GO (т.е. тех процессов, которые наиболее частовстречаются при том или ином фенотипе). Анализ был проведен как длягруппбелков/генов,ассоциированныхотдельноcкаждымизрассматриваемых заболеваний, так и для групп белков/генов, общих для парзаболеваний (PE & DM, PE & GD, PE & Ob), а также для белков/генов,ассоциированных одновременно с 4 заболеваниями (Glotov et al., 2015a). Вкаждом варианте найдено более 1000 сверхпредставленных процессов.Восемь наиболее значимых из них приведено в таблице 25.Сверхпредставленнымиоказалосьмногообщихбиологическихпроцессов, для которых аннотированы тысячи генов. Для того чтобыпроверитьнасколькотесновзаимодействуютмеждусобойэтисверхпредставленные белки/гены, для каждого процесса был рассчитаниндекс CR (безразмерный показатель, применяемый в биологии дляколичественного определения степени сходства биологических объектов).После ранжирования оказалось, что максимальному значению индексаCR, равному 1 соответствовало 313 сверхпредставленным биологическмпроцессам (Glotov et al., 2015a).
Приэтом для неспецифическихбиологических процессов значение CR, как правило, было ниже, чем для212213специализированных, в которых участвует относительно небольшое числогенов.К процессам с максимальным CR относились: регуляция активностимонооксигеназы, липидный метаболизм, метаболизма оксида азота и окисиуглерода,сигнальныйкаскадпротеинкиназыВ,активностьтранскрипционного фактора NF-kappaB, метаболизм и транспорт глюкозы,клеточный ответ на оксидативный стресс, продукция цитокинов и другие.3.2.1.2.1.5. Реконструкция ассоциативных сетей гестоза, сахарного диабета,ожиренияидиабетабеременныхнаоснованииданныхсверхпредставленности биологических процессов.Проведена реконструкция молекулярно-генетических взаимодействиймежду генами PLAT, ADIPOQ, ADRB3, LEPR, HP, TGFB1, TNFA, INS, CRP,CSRP1, IGFBP1, MBL2, ACE, ESR1, SHBG, ADA, выявленными с помощьюанализа сверхпредставленности биологических процессов, и программами«ANDSystem» и «STRING (рис.
28). После фильтрации сети 4-го уровня(также как в п. 3.2.1.2.1.2) было выявлено 9-ть наиболее значимых геновPLAT, ADIPOQ, LEPR, TGFB1, TNFA, INS, IGFBP1, ACE, ESR1 и установленыобщие факторы риска для таких сочетаний как: гестоз +сахарный диабет,гестоз +сахарный диабет + ожирение, гестоз + все 3 заболевания, гестоза +ожирения. Были так же выделены специфичные факторы риска (см. рис. 28).Наибольшее число связей отмечено для генов TNFA, TGFB1, INS.
Эти гены,как было установлено, участвуют во многих процессах с высоким индексомCR, таких как: позитивная регуляция сигналинга протеинкиназы B («positiveregulation of protein kinase B signaling»), регуляция митоза («regulation ofmitosis»), регуляция деления ядра («regulation of nuclear division») и другие(Glotov et al., 2015a).213214Таблица 25. Основные характеристики сверхпредставленности биологических процессов GO, установленные приизучении белков/генов, ассоциированных с гестозом, СД, ожирением и гестационным диабетом (по Glotov et al., 2015a).ПолноечислоЧислобелковбелковпроцессавGO в базегеннойданныхсетиUniProtGOAПолное числобелков в сети,для которыхизвестен, покрайней мере,одинбиологическийпроцесс GO3221541121541331533715Полное числобелков человека,для которыхизвестен, поНазваниекрайней мере,процессаодинбиологическийпроцесс GOПозитивнаярегуляция30780 активностимонооксигеназырегуляциядифференциа30780ции жировыхклетокПозитивнаярегуляция30780метаболизмалипидовНегативная30780 регуляцияуглеводногоСкорректированный уровеньCR-индексзначимости, «pvalue»Белки,вовлеченныев процесс1,65*10-51TNFA|ESR1|INS1,95*10-51TNFA|ADIPO|INS|TGFB12,98*10-51TNFA|ADIPO|INS|TGFB13,79*10-51ADIPO|INS|TGFB12142153381530780338153078035215307803571530780обменаПозитивнаярегуляциябиосинтезаокиси азотаПозитивнаярегуляцияоксидоредуктазыНегативнаярегуляциядифференциации жировыхклетокрегуляцияактивностимонооксигеназы3,89*10-51TNFA|ESR1|INS3,89*10-51TNFA|ESR1|INS7,23*10-51TNFA|ADIPO|TGFB18,42*10-5TNFA_HUMAN|ESR1_H1UMAN|INS_HUMAN215216Рисунок 28.
Ассоциативная сеть генов и белков, общая для гестоза,сахарного диабета, ожирения и диабета беременных (по Glotov et al., 2015a).Ассоциативная сеть генов и белков, общих для анализируемыхзаболеваний, включала 67 генов и 167 связей (см. рис. 28), из которых 78были отнесены к «ассоциациям» (черный цвет), 69 - к регуляторамэкспрессии и 13 – коэкспрессии (красный цвет), 8 связей отражалиподавление активности или различные варианты её нарушения (фиолетовыйцвет) (Glotov et al., 2015a).Специфичными факторами риска гестоза в данной сети оказались: генинтерлейкина 1В (IL1B), ген эндотелиальной NO-синтазы (NOS3), ген белкатепловогошока4(HSP74),генаполипопротеинаJ(CLU),5,10-метелентетрагидрофолат редуктаза (MTHFR).Исходя из анализа ассоциативных сетей, можно считать, что в отличиеотСД,ГД,ОЖ,именноэтигеныследуетрассматриватькакдифференциальные факторы риска гестоза. Можно предполагать, чтометаболический путь, нарушения которого ведут к гестозу, «стартует» собщих генов - TGFB1, TNFA, INS, ACE, нарушает экспрессию генов IL1B,NOS3, HSPA4, CLU, MTHFR и манифестирует как прогрессирующее216217осложнение беременности - гестоз (ПЭ).
Не исключены и другие сценариимолекулярного патогенеза гестоза (ПЭ): TGFB1 или TNFA - IL1B - ПЭ; TNFAили INS - NOS3 - ПЭ; INS – HSPA4 или CLU - ПЭ; ACE - MTHFR – ПЭ.Следовательно, а зависимости от аллельных вариантов кандидатных генов ипровоцирующих экзогенных факторов начальные стадии патогенеза гестозамогут быть различными, однако, начиная с ранних этапов, процессстановится канализированным и, в конечном счете, проявляется в видехарактерной для гестоза клинической триаде: гипертония, нарушения почек иотеки.3.2.1.2.2.
Секвенирование гена ACVR2A у женщин с гестозом и у женщин сфизиологической беременностью.Для комплексного изучения новых маркеров гестоза был примененподход с использованием метода полногеномного секвенирования. Вкачестве платформ для секвенирования были выбраны приборы «GS Junior»фирмы «Roche» и «Ion Torrent» фирмы «Life Technologies», основнымидостоинствами которых является возможность быстрого секвенированияпротяженныхфрагментовДНК,пригодныедляпоследующиегобиоинформационного анализа в автоматическом режиме.Объектом исследования были образцы ДНК 43-х женщин с гестозом и22-х женщин контрольной группы (табл.
26).Фрагменты гена ACVR2A длиной 89060 п.о. секвенировали с 30-тикратнымпокрытием.Суммарнов65-тиобразцахвыявлено246нуклеотидных вариаций, половина из которых не представлена в базахданных «1000 геномов» и «dbSNP135», а 135 имеют номер «rs». 25 заменпредставляют собой делеции/инсерции и 221 – однонуклеотидные вариации(SNP). Длина вариантов - в пределах от одного до девятнадцати нуклеотидов.217218Таблица 26. Секвенирование гена ACVR2A. Клинические характеристики пациентов и женщин контрольнойгруппы.Исследуемые Наличиепараметры гипертониинетЧисло23пациентов сгестозом/Среднее значениеЧисло22пациентовконтрольнойгруппы/Среднее значениеда200НаличиеСтепеньНаличиеСАДДАДПротеинурия,сахарного тяжести гестоза отеков (мм.рт.ст.) (мм.рт.г/лдиабетаст.)до/во времябеременностидо вовремя легкая средняя нет даитяжелая25 18637934145,3±14,6 91,6±1 0,15±0,293,30000220110,2±10,270,6±10,30±0,012182193.2.1.2.2.1.
Поиск клинически значимых нуклеотидных замен в гене ACVR2Aу женщин с гестозом.«Фильтрацию» данных секвенирования образцов ДНК проводили сиспользованием двух биоинформатических подходов.Первый проведен с применением общедоступных интернет-ресурсов «Gene-Talk» (http://www.gene-talk.de). Ресурс позволяет «отфильтровывать»данные по разным критериям, одним из которых является научная иклиническая значимость выявленного генетического маркера (см. рис.
29).Задачей данного этапа было выяснить, какие, и в каком количестве упациенток с гестозом встречаются клинически значимые варианты.После «фильтрации» данных было установлено, что максимальнойнаучной и медицинской значимостью, обладает 31 из 246 обнаруженныхвариантов (см. табл. 27). Наличие этих вариантов было подтверждено в«ручном режиме» с помощью программы «UGENE» (Okonechnikov et al.,2012).Клинически значимые варианты обнаружены у каждой пациентки, причем, у некоторых из них былы выявлены несколько таких заменодновременно.Наэтоуказываютдостаточновысокаячастотаальтернативного варианта (табл. 27), которая в ряде случаях достигала 80100% (например, для rs1424943).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
