Диссертация (1144820), страница 28
Текст из файла (страница 28)
Сравнение сумм балловпроводили с помощью критерия Манна-Уитни.Анализ межгенных взаимодействий был произведён с помощьюпрограммыMDR(Ritchieetal.,2001)сприменениемалгоритма170всестороннего поиска (exhaustive search). Для полученных сочетанийкомбинаций аллелей повышенного и пониженного риска с использованиемточного теста Фишера были рассчитаны p-значения и показатель отношенияшансов.Логистические регрессионные модели для предсказания риска развитиязаболеваний были построены в среде «R», отбор значимых предикторов длямоделей осуществлялся алгоритмом «stepwise», в ходе работы котороговыбирали предикторы, минимизирующие значение коэффициента «AIC»(«Akaikeinformationcriteria»)модели.Длясравнительногоанализаполученных моделей были построены соответствующие «ROC-кривые».Расчеты проводили с применением пакетов программ «GraphPadInStat» (США), «STATISTICA 12.0 (США) и в среде для статистическихвычислений «R» (http://www.R-project.org/) c помощью программы «R CloudWorkbench» (Goncalves et al., 2011).171ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ3.1.Разработкабиочип-тест-системдляанализагенетическогополиморфизма.Ранее нами был разработан алгоритм создания биочипов (Глотов и др.,2005; Глотов и др., 2007; Глотов, 2011).
В рамках данного алгоритма былисозданы «Фармакогенетический биочип» и «Кардио-чип». Для реализациицели настоящей работы был разработан еще один тематический микрочип «Фибр-биочип».3.1.1. Система свертывания крови – «Фибр-биочип».3.1.1.1. Выбор генов и полиморфных вариантов.При создании «Фибр-биочипа» были выбраны вариабельные участки 6генов: F5 (1691G>A), F2 (20210G>A), SERPINE1 или PAI1 (-675 5G>4G),FGB (455G>A), ITGB3 или GP3a (1565Т>С) и MTHFR (677C>Т), которыеассоциированы с регуляцией процессов коагуляции и имеют важное значениев развитии патологии беременности (см.
п. 1.5.1.1). Популяционные частотыаллелей генов, включенных биочип известны, и функционально значимы.3.1.1.2. Схема биочипа.Схема «Фибр-чипа» показана на рис. 15. Олигонуклеотидные зондыобозначены ячейками, каждой из которых соответствует определеннаяаллель или гаплотип конкретного гена.Олигонуклеотидные пробы в составе биочипа сгруппированы в блоки.Блок №1 предназначен для выявления полиморфизма по генам F5(1691G>A),F2(20210G>A),FGB(455G>A).Выявлениеэтиходнокуклеотидных замен позволяет выявлять как мутантные аллели:1691F5*A, 20210F2*A, 455FGB*A, так аллели дикого типа - 1691F5*G,20210F2*G, 455FGB*G, вышеперечисленных генов.172Рисунок 15. Схема «Фибр-чипа» (Вашукова и др., 2008).
Ячейки стекстом черного цвета соответствуют олигонуклеотидам, комплементарнымпоследовательностям «дикого типа», красного цвета – последовательностям«мутантного типа». Каждый олигонуклеотид на биочипе представлен двумякопиями. 0 обозначен гель без зондов.Блок №2 предназначен для анализа полиморфизма в генах SERPINE1или PAI1 (-675 5G>4G), ITGB3 или GP3a (1565Т>С) и MTHFR (677С>Т), ипозволяет тестировать аллели «дикого типа»: -675PAI1*5G, 1565GP3a*T,677MTHFR*Cи«мутантные»аллели:-675PAI1*4G,1565GP3a*C,677MTHFR*T.Примеры гибридизаций на этом биочипе приведены на рис.
16.Рисунок 16. Гибридизация на «Фибр-чипе» (Вашукова и др., 2008).Стрелками на рисунке и красным шрифтом в подписях отмеченыобнаруженные «мутантные» варианты (овалом выделены такие ячейки).1733.1.1.3. Анализ контрольных и диагностических образцов.Биочип протестирован на 100 контрольных и 300 клиническихобразцах. Результаты тестирования контрольных образцов (идентификациямутаций в них проводили так же методами ПДРФ-анализа, секвенированиеми другими) показали полное совпадение. Анализ клинических образцоввыявил пять расхождений из 1800 проанализированных полиморфныхвариантов.
Таким образом, точностьданного метода равна 99,9%.Чувствительность биочипа сопоставима с таковой у «Фармакогенетическогобиочипа» и «Кардиобиочипа» (Глотов и др. 2005, 2007), и составляет 10 нггеномной ДНК.3.1.2. Заключение.Технология биочипов удобна для быстрого и точного определения(скринирования) несколько десятков замен. Разработанный нами блочныйпринципконструированиябиочипапозволяетдостаточнобыстроадаптировать эту технологию для решения практических задач. Блочныйподход особенно предпочтителен для анализа генетических маркеровопределенныхметаболическихпутей(вслучае«Фибр-биочипа»и«Кардиочипа»).3.2.
Исследование генов-кандидатов и поиск новых генетическихмаркеров риска гестоза, артериальной гипертензии и ожирения сметаболическим синдромом.В главе приведены результаты изучения известных генов-кандидатовряда МФЗ с использованием технологии биочипов, так же результаты поискановых маркеров этих заболеваний с помощью генных сетей, полногеномного,транскриптомного и эпигеномного анализов.3.2.1.
Наследственные маркеры гестоза.Использованы несколько подходов: а) «классический» - сравнительныйанализ частот аллелей и комбинации аллелей генов-кандидатов у больных и в174группеконтроляб)корреляционныйанализмежду определеннымигенотипами и «основными» клиническими параметрами патологии, в)построение математических моделей риска заболевания.3.2.1.1. Молекулярно-генетические маркеры гестоза.3.2.1.1.1. Частоты аллелей и их комбинаций по 16 генам-кандидатам уженщин с гестозом, в группе сравнения и у доноров.С помощью биочипов: «Кардио-биочип» (Глотов и др., 2007), «Фибрбиочип» (см.
п. 3.1.1) и методом ПЦР-ПДРФ изучены полиморфные сайтыследующих 16-ти генов: REN (-83G>A), AGT (M235T), AGTR1 (1166A>C),AGTR2 (3123C>A), BDKRB2 (-58T>C), ADRB2 (48A>G, 81C>G), MTHFR(677C>T), F5 (1691G>A), ITGB3 (196C>T), SERPINE1 (5G>4G), FGB(455G>A), F2 (20210G>A), APOE (E2, E3,E4), LPL (Ser447Stop), NOS3 (786T>C), ACE (I/D).Частоты аллелей и их комбинаций по генам REN, AGT, AGTR1, AGTR2,BDKRB2, ADRB2, MTHFR, NOS3, APOE, LPL, F5, ITGB3, SERPINE1, FGB, F2в исследованных группах представлены в таблице 12 и 13.Как следует из приведенных данных, в большинстве случаевраспределение частот комбинаций аллелей соответствовало закону ХардиВайнберга(2<3,84;р>0,05).Однакодлянекоторыхгеновтакогосоответствия не соблюдалось.
В частности, среди женщин с гестозомотклонение от закона Харди-Вайнберга показано для генотипа по гену REN(2=17,68; р<0,001), по гену NOS3 (2=3,90; р=0,04), по гену LPL (2=18,70;р=0,002) и по гену SERPINE1 (2=5,18; р=0,03); среди беременных женщинконтрольной группы – для гена BDKRB2 (2=4,15; р=0,03), гена NOS3(2=6,81; р=0,01) и гена ADRB2 (2=14,21; р<0,001 и 2=31,67; р<0,001, длязамен 48A>G и 81C>G, соответственно); в группе доноров – для гена ADRB2(2=5,54; р=0,02, замена 81C>G) (выделены в табл.
16).175Таблица 12. Частоты аллелей и их комбинаций 14-ти генов убеременных с гестозом и в группах сравнения.Ген/группыRENБеременные,гестоз(n=145)Беременные, контроль(n=100)Доноры (n=219)Доноры(женщины)(n=74)AGTБеременные,гестоз(n=145)Беременные, контроль(n=100)Доноры (n=222)Доноры(женщины)(n=75)AGTR1Беременные,гестоз(n=145)Беременные, контроль(n=100)Доноры (n=222)Доноры(женщины)(n=75)AGTR2Беременные,гестоз(n=145)Беременные, контроль(n=100)Доноры (n=222)Доноры(женщины)(n=75)BDKRB2Беременные,гестоз(n=145)Беременные, контроль(n=100)Доноры (n=222)Доноры(женщины)Частоты аллелей,%GA84,815,2Частоты комбинацийаллелей, %G/GG/AA/A75,917,96,288,511,580,017,03,082,083,118,016,971,271,621,523,07,35,4M51,4T48,6M/M24,8M/T53,1T/T22,155,544,534,043,023,049,351,350,748,723,924,050,954,725,221,3A77,9C22,1A/A57,9A/C40,0C/C2,174,026,054,040,06,077,880,722,219,356,562,742,636,00,91,3C50,0A50,0C/C29,0C/A42,1A/A29,043,556,516,055,029,050,547,349,552,739,422,722,260,038,517,3T43,1C56,9T/T17,2T/C51,7C/C31,038,561,510,057,033,045,349,354,750,718,922,752,753,328,424,0176(n=75)MTHFRБеременные,гестоз(n=145)Беременные, контроль(n=100)Доноры (n=222)Доноры(женщины)(n=75)ADRB2Беременные,гестоз(n=144)Беременные, контроль(n=100)Доноры (n=223)Доноры(женщины)(n=75)ADRB2Беременные,гестоз(n=142)Беременные, контроль(n=100)Доноры (n=220)Доноры(женщины)(n=75)NOS3Беременные,гестоз(n=59)Беременные, контроль(n=100)Доноры (n=196)Доноры(женщины)(n=47)LPLБеременные,гестоз(n=59)Беременные, контроль(n=100)Доноры (n=209)Доноры(женщины)(n=59)F5Беременные,гестозC68,6T31,4C/C44,1C/T49,0T/T6,974,525,558,033,09,067,362,732,737,346,842,741,040,012,217,3A44,8G55,2A/A22,9A/G43,8G/G33,346,553,531,031,038,039,236,760,863,315,214,748,044,036,841,3C63,7G36,3C/C42,3C/G43,0G/G14,871,029,062,018,020,061,455,338,644,743,637,335,536,020,926,7T61,9C38,1T/T32,2T/C59,3C/C8,561,039,031,060,09,062,867,037,233,039,848,945,936,214,314,9C91,5G8,5C/C88,1C/G6,8G/G5,190,59,582,017,01,092,895,87,24,286,691,512,48,51,00,0G97,9A2,1G/G95,9G/A4,1A/A0,0177(n=146)Беременные, контроль(n=104)ITGB3Беременные,гестоз(n=146)Беременные, контроль(n=104)SERPINE1Беременные,гестоз(n=146)Беременные, контроль(n=104)FGBБеременные,гестоз(n=146)Беременные, контроль(n=104)F2Беременные,гестоз(n=146)Беременные, контроль(n=104)99,01,098,11,90,0T82,5C17,5T/T69,2T/C26,7C/C4,182,717,367,330,81,95G4G41,158,95G/5G12,35G/4G57,54G/4G30,146,653,426,041,332,7G74,7A25,3G/G56,2G/A37,0A/A6,875,025,057,734,67,7G99,7A0,3G/G99,3G/A0,7A/A0,097,12,994,25,80,0Таблица 13.
Частоты аллелей и их комбинаций гена APOE убеременных с гестозом и в группах сравнения.ГенЧастотыаллелей, %APOEE2E3E4Беременные,гестоз(n=61)Беременные,контроль(n=100)Доноры(n=227)Доноры(женщины)(n=74)5,786,15,0Частоты комбинаций аллелей, %8,2E2/E20,0E2/E311,5E2/E41,1E3/E375,4E3/E49,8E4/E43,384,011,00,010,00,069,021,01,09,477,912,71,313,71,362,619,81,35,482,412,20,010,80,064,924,30,0178Учитывая наличие несоответствия в распределении частот комбинацийаллелей для гена ADRB2 закону Харди-Вайнберга в контрольной группедоноров и среди беременных (в отличие от других генов), сравнительныйанализ по этому гену в дальнейшем не проводили.3.2.1.1.2.
Сравнительный анализ частот аллелей и их комбинаций геноврегуляторов артериального давления, свертывания крови и липидного обменау женщин для гена APOE не выявил статистически значимых различиймежду группой женщин с патологией беременности (гестоз) и женщинами сфизиологической беременностью (p=0,29; df=2 – для комбинации аллелей иp=0,70;df=4–дляаллелей,соответственно).Небыловыявленостатистически значимых различий по частотам комбинаций аллелей иаллелей между группами доноров и беременными с гестозом (p=0,07; df=2 –для комбинации аллелей и p=0,57; df=4 – для аллелей, соответственно), атакже между донорами (женщины) и беременными контрольной группы(p=0,74; df=2 – для комбинации аллелей и p=0,93; df=4 – для аллелей,соответственно) (см. таблицы 14, 15 и 16).Ген REN. Сравнительный анализ частот аллелей и их комбинаций длягена REN не выявил статистически значимых отличий между группой сгестозом и контрольной группой беременных женщин (p=0,50, χ2=1,40 иp=0,30, χ2=1,06 для комбинации аллелей и аллелей, соответственно); а такжемежду группой с гестозом и группой женщин-доноров (p=0,67, χ2=0,81 иp=0,74, χ2=0,11) и между группой беременных и группой женщин-доноров(p=0,41, χ2=1,78 и p=0,20, χ2=1,65) (см.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
