Диссертация (1144820), страница 26
Текст из файла (страница 26)
Удаляли весь супернатант заисключением 100 мкл на дне пробирки, ресуспензировали и встряхивалиоставшейся раствор в течение 30 сек. Переносили 2 мкл аликвотынеобогащенныхмикрочастицвотдельную0,2млпробиркудляпоследующего контроля качества обогащения микросфер. Остальной объеммикросфер использовали для последующего «обогащения».160Далее согласно инструкции к набору готовили денатурирующийраствор, содержащий 865 мкл воды без нуклеаз, 125 мкл 1 M NaOH и 10 мкл10% Твин-20 («Amresco», США) (растворенного в воде). Параллельноотмывали и ресуспензировали микросферы со стрептавидином «Dynabeads®MyOne™ Streptavidin C1 Beads» («Life technologies», США).После «необогащенные» микросферы, микросферы со стрептавидином,денатурирующий и «отмывочный» растворы переносили в соответсвующиеячейки специльного стрипа для обогащения согласно инструкции к набору«Ion OneTouch™ 200 Template Kitv2 DL» («Life technologies», США).
Далеепомещали стрип на прибор для «обогащения» микросфер «Ion OneTouch™ES» («Life technologies», США). Подготовку прибора и его запускосуществляли согласно руководству к эксплуатации.Пробирку, содержащую обогащенные микросферы, центрифугировали1,5 (2) минуты при 15,500×g (13000×g). Удаляли весь супернатант заисключением10мкл,добавляли100мклотмывочногораствора,пипетировали вверх вниз не менее 10 раз. Снова центрифугировали 1,5 (2)минуты при 15,500×g (13000×g). Анализировали на наличие коричневогоосадка. В случае такового, процедуру отмывки повторяли.
В отсутствииосадка, удаляли из пробирки весь супернатант за исключением 10 мкл,добавляли до 100 мкл отмывочного раствора, пипетировали вверх вниз неменее 10 раз. «Обогащенные» микросферы хранили не более трех дней притемпературе +40С. Для контроля качества обогащения 10 мкл микросферпереносили в отдельную 0,2 мл пробирку.Для контроля качества использовали набор реагентов «Ion Sphere™Quality Control» («Life technologies», США).
Подготовку контрольныхрастворов и растворов, содержащих необогащенные и обогащенныемикросферы, осуществляли согласно инструкции к набору «Ion OneTouch™200 Template Kit v2 DL» («Life technologies», США). Для оценкифлуоресцентных сигналов использовали прибор «Qubit» («Invitrogen»,США).161Расчеты производили, используя «Qubit® 2.0 Easy Calculator»(«Invitrogen», США). Секвенирование проводили при следующих процентахмикрочастиц, содержащих матрицу: 10-90% для необогащенных и 50-150%для обогащенных микросфер.2.9.1.5.
Секвенирование на микрочипах.Дляпроведениясеквенированияиспользовалиполовину«обогащенных» микросфер (50 мкл)(«Ion 314™ Chip») или весь объем («Ion316™ Chip»или «Ion 316™ Chip»). Часть микросфер хранили притемпературе +40С при необходимости повторного анализа.Запуск прибора планировали, внося соответствующие стартовыехарактеристики, на специальном ресурсе «Torrent Browser», согласноинструкции «Torrent Suite 3.4.1» («Life technologies», США).Перед каждым запуском секвенирования на приборе «Ion torrent»осуществляли «промывку» прибора, как описано в инструкции «Ion PGM™Sequencing 300 Kit» или «Ion PGM™ Sequencing 200 Kit» («Life technologies»,США).Послепромывкиприборапроводилитакназываемуюинициализацию. Для этого, согласно инструкции «Ion PGM™ Sequencing 300Kit»или «Ion PGM™ Sequencing 200 Kit» («Life technologies», США),готовилиспециальныебуфера,необходимыедлякалибровкиpHциркулирующей жидкости в приборе в диапазоне значение от 7,55 до 7,75.При достижении нужного значения pH процесс продолжали, подготавливаярастворы, содержащие четыре соответсвующие дНТФ.
В отсутствии нужногодиапазона значений, pH «доводили вручную», используя 1Н HCl и NaOH(«Реактив», Россия). Для инициализации использовали «старый» микрочип,оставшийся с предыдущего запуска.А) Секвенирование с применением чипа «Ion 314™ Chip».Послеуспешногопрохожденияинициализацииприступаликподготовке «нового» микрочипа «Ion 314™ Chip» («Life technologies»,США). Перед загрузкой проб на микрочип, в пробирку 0,2 мл, содержащую162«обогащенные» микросферы (50 мкл) добавляли 5 мкл контрольных частиц«Control Ion Sphere™ Particles» («Life technologies», США), 100 мкл буферадля отжига «Annealing Buffer» («Life technologies», США). После пробиркуцентрифугировали 2 (3) минуты при 15,500×g (13000×g). Далее из пробиркиудаляли весь супенатант за исключением 3 мкл. К этим 3 мкл добавляли 3мкл секвенирующего праймера «Sequencing Primer» («Life technologies»,США), пипетировали и ставили амплификацию на термоциклере «Verity»(«Life technologies», США) при следующих условиях: 950C 2 мин и 370C 2мин.
После приступали к процедуре проверки качества микрочипа – «ChipCheck» - согласно протоколу «Ion PGM™ Sequencing 300 Kit» или «IonPGM™ Sequencing 200 Kit» («Life technologies», США). Во время этойпроцедуры вместо использованного микрочипа инсталировали новый. Послепроцедуры провеки микрочипа к 6 мкл смеси, содержащей пробу, добавляли1 мкл «Ion PGM™Sequencing 300 Polymerase» или «Ion PGM™ Sequencing 200Polymerase» («Life technologies», США), пипетировали и оставляли смесь на 5минут при «комнатной» температуре.Б) Секвенирование с применением чипа «Ion 316™ Chip» или «Ion 318™Chip».Послеуспешногопрохожденияинициализацииприступаликподготовке «нового» микрочипа «Ion 316™ Chip» или «Ion 318™ Chip»(«Life technologies», США).
Перед загрузкой проб на микрочип, в пробирку0,2 мл, содержащую «обогащенные» микросферы (100 мкл) добавляли 5 мклконтрольных частиц «Control Ion Sphere™ Particles» («Life technologies»,США), 100 мкл буфера для отжига «Annealing Buffer» («Life technologies»,США). После пробирку центрифугировали 2 минуты при 15,500×g.
Далее изпробирки удаляли весь супенатант за исключением 12 мкл. К этим 12 мклдобавляли 15 мкл секвенирующего праймера «Sequencing Primer» («Lifetechnologies»,США),пипетировалииставилиамплификациюнатермоциклере «Verity» («Life technologies», США) при следующих условиях:950C 2 мин и 370C 2 мин. После приступали к процедуре проверки качества163микрочипа – «Chip Check» - согласно протоколу «Ion PGM™ Sequencing 300Kit» или «Ion PGM™ Sequencing 200 Kit» («Life technologies», США). Вовремя этой процедуры вместо использованного микрочипа инсталировалиновый. После процедуры провеки микрочипа к 27 мкл смеси, содержащейпробу, добавляли 3 мкл«Ion PGM™ Sequencing 300 Polymerase» или «IonPGM™Sequencing200Polymerase»(«Lifetechnologies»,США),пипетировали и оставляли смесь на 5 минут при «комнатной» температуре.В) Загрузка микрочипов и установка в геномный севенатор.Далее, согласно инструкции «Ion PGM™ Sequencing 300 Kit» или «IonPGM™ Sequencing 200 Kit» («Life technologies», США) для соответствующихнаборов, осуществляли загрузку микрочипа пробой.
При загрузке микрочипаприменяли центрифугирование (согласно протоколам к микрочипу «Ion314™ Chip» или «Ion 316™ Chip» или «Ion 316™ Chip»), используяминицентрифугу для микрочипов «MiniFuge» («Life technologies», США).Подготовленный микрочип помещали на геномный секвенатор «IonPGM™System»(«Lifetechnologies»,США).Запускприбора,егопоследующую «чистку» и эксплуатацию осуществляли согласно руководствук эксплуатации «Ion Personal Genome Machine® System» и соответствующиминструкциям: «Ion PGM™ Sequencing 300 Kit» или «Ion PGM™ Sequencing200 Kit», «Torrent Suite 3.4.1» («Life technologies», США).2.9.1.6.
Анализ полученных данных.Анализполученныхданныхпроводилипутемвыравниваниянуклеотидных последовательностей против референсного геном HG 19LT,используя ресурс «Alignment v3.6.56201», и генерирования необходимыхфайлов форматов (*.fastq, *.bam и *.vcf) с помощью интернет-сервера«TorrentServer»согласноинструкции«TorrentSuite3.4.1»(«Lifetechnologies», США).
Поиск нуклеотидных замен осуществляли, используястандартные установки ресурса «variant Caller v3.6.63335» этого же сервера,и, используя программу «UGENE» («Unipro», Россия).1642.9.2. NGS секвенирование на приборе «GS Junior».2.9.2.1. Создание ДНК-библиотек.Библиотеки создавали так же, как описано в п. 2.9.1.2.9.2.2. Подготовка библиотек для секвенированияВсе амплифицированные фрагменты, соответствующие образцу ДНКкаждого отдельного индивидуума, смешивали в эквимолярных количествах.Полученную смесь фрагментов ДНК (в количестве 1 мкг для каждогопациента) фрагментировали методом небулизации с помощью набора «GSRapid Library Prep Kit» («Roche», Швейцария) для получения фрагментовразмером 700 п.н. После фрагменты лигировали с олигонуклетиднымиадаптерами из набора «GS Rapid Library MID Adaptors Kit» («Roche»,Швейцария),содержащимиучастокдлясвязыванияуниверсальныхпраймеров для амплификации, обогащения и секвенирования библиотеки, атакже, уникальный для каждого пациента, 10-нуклетидный идентификатор.Полученные библиотеки очищали с помощью частиц «AMPure XP»(«Beckman Coulter», США), определяли концентрацию полноразмерныхфрагментов с помощью ДНК-флюориметра и оценивали распределениеразмеров фрагментов ДНК с помощью электрофоретической микрочиповойсистемы «MCE-202 MultiNA» («Shimadzu», Япония).Полученные библиотеки отдельных образцов ДНК смешивали вравных количествах и амлифицировали методом эмульсионной ПЦР спомощью набора «GS Junior Titanium emPCR Kit (Lib-L)» («Roche»,Швейцария).
После проведения эмульсионной ПЦР полученные частицы самплифицированной библиотекой обогащали за счет проведения очистки отчастиц, не содержащих полноразмерные амплифицированные фрагменты.1652.9.2.3. Секвенирование на микрочипах.Секвенирование полученной библиотеки проводили с помощью набора«GS Junior Titanium Sequencing Kit» («Roche», Швейцария) и прибора «GSJunior» («Roche», Швейцария) по стандартной процедуре.2.9.2.4. Анализ полученных данных.Выравнивание полученных нуклеотидных последовательностей среференсной последовательностью гена ACVR2A проводили с помощьюпрограммы «GS Reference Mapper» («Roche», Швейцария), генерируя файлынеобходимого формата (*.sff).2.9.3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
