Диссертация (1144820), страница 22
Текст из файла (страница 22)
Экстракция микроРНК.ДлясозданияколлекцииобразцовмикроРНКизплацентыиспользовали набор реагентов «PureLink miRNA Isolation Kit» («Lifetechnologies», США).Для этого:1. Отделяли плодовую ткань плаценты от материнской. Переносили около 5мг клеточного материала в лизирующий буфер «L3» (300 мкл) наборареагентов «PureLink miRNA Isolation Kit» («Life technologies», США)согласно инструкции, рекомендованной производителем.2. Далее получали микроРНК, используя набор реагентов «PureLink miRNAIsolation Kit» («Life technologies», США).3.
Качество и количество микроРНК оценивали, используя метод гельэлектрофорезанаприборе«2200TapeStationInstrument»(«Agilenttechnologies», США), а также на приборе «Qubit® 2.0 Fluorometer» спомощью набора реагентов «Quant-iT™ microRNA Assay Kit» («Lifetechnologies», США) и (см. п. 2.9.2).4. РНК хранили при температуре -80°C.2.5.
Обратная транскрипция и получение кДНК.Для создания коллекции образцов кДНК использовали набор реагентов«Ion Total RNA-Seq2 Kit», рекомендованный «Life technologies» (США) дляприготовлениябиблиотексцельюпоследующегополногеномногосеквенирования, согласно инструкции производителя (см. п. 2.9.2).2.6. ПЦР/ПДРФ анализ.2.6.1.
Выбор праймеров.Нуклеотидныепоследовательностиискомыхфрагментовгеновполучали из интернет-базы «Nucleotide» и «Ensembl» («NCBI», США иЕвропейскийсоюз,соответсвенно).Праймеры,необходимыедляамплификации этих фрагментов, подбирали с использованием программы134«Oligo 6» (США). Специфичность праймеров проверяли в программе«Nucleotide-nucleotide BLAST» («NCBI», США).2.6.2. Амплификация фрагментов ДНК.Методом полимеразной цепной реакции исследовали полиморфизмгена: ACE.
Методом ПЦР с последующим ПДРФ-анализом исследовалиаллельные варианты шести генов: PTGIS, CYP2J2, CYP4A11, СDH13,MTHFR, CDKN2/BAS и одного межгенного маркера. Типы изученныхаллельных вариантов, последовательности олигопраймеров приведены втаблице 3.Таблица 3. Нуклеотидные последовательности праймеров для ПЦР споследующим анализом методом ПААГ.ГенАСЕPTGISCYP2J2CYP4A11СDH13MTHFRCDKN2/BASМежгенныймаркерИсследуемыйаллельныйвариант/номерrsI/Drs4340G/Ars6090996Последовательность 5’-3’CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCTATGTGGCCATCACATTCGTCAGATGTCCATCACTTAAATAGCCAGGCAACCCTCCCTAACTTGCCACAGC-50G>Trs8902938590T>Crs1126742A/Trs11646213A/Grs17367504A/Grs4977574T/Crs11191548TTTCTGAGACCGGTGCGTGTCCGAGAGTCCGAGGATGGACCACTGAGAGGAGGAAATGAGGTGATCCAGCAGAACCCGGTGCAAAGCGGAGGAAGGTGGTCCTTGCCCTTCCTTGGACAAACACTACAACGCTGTGAGGGACTTTTACAGGCCAСACTCATGCAAGGTTAAGGTGGGAGGTAACCACATGTCAGTAGCATGTCATTGAGTCCCTTCAGCAAGCCCGCCCAGTGAGGAATTGGAGCCCAGCAATTTTTCCAAGGCTGCCРеакционная смесь для амплификации, объемом 25 мкл, включала:0,4пМ каждого праймера, 6,7 мМ Трис-HCl pH 8,6, 16,6 мМ (NH4)2SO4,1350,001% Тритон Х-100, 1,5 мМ MgCl2, 0,4 мМ каждого dNTP («Силекс»,Россия), 2,5 ед.
акт. Taq-полимеразы («Силекс», Россия), 1 мкл ДНКматрицы. Для амплификации использовали программируемые термоциклеры«MJ Mini», «MY Cycler» фирмы «BioRad» (США) и «Терцик» («ДНКтехнология», Россия).После предварительной денатурации ДНК (5 минут при 94оС)проводили амплификацию в режиме:для гена ACE (33 циклов): 950С (1мин), 600С (1мин), 720С (1мин).Заключительный синтез 72оС - 5 мин;для генов PTGIS, CYP2J2, CYP4A11, СDH13, MTHFR, CDKN2/BAS имежгенного маркера (37 циклов): 950С (30 сек), 600С (30 сек), 720С (1 мин).Заключительный синтез 72оС - 5 мин.2.6.3. Обработка эндонуклеазами рестрикции.ИсследованиеCDKN2/BASиаллельныхмаркеравариантовrs11191548геновпроводилиСDH13,путемMTHFR,обработкиэндонуклеазами рестрикции продуктов амплификации соответствующихгенов (см.
табл. 4). Для гидролиза брали 5 мкл ПЦР-продукта к которомудобавляли следующуюсмесь реактивов: деионизованную воду, эндонуклеазурестрикцииибуфер,рекомендованныйпроизводителемдлясоответствующей рестриктазы (использовали ферменты «СибЭнзим», Россияи «Fermentas», Латвия). Гидролиз эндонуклеазами рестрикции проводилисогласно рекомендациям производителя.Таблица 4. Характеристика использованных эндонуклеаз рестрикцииГенЭндонуклеазарестрикцииСайтСDH13SspIAAT↑ATTTTA↓TAAMTHFRBssECIC↑CNNGGGGNNC↓C136CDKN2/BASHspAIG↑CGCCGC↓GМежгенный маркерrs11191548Tai1 («Fermentas»)ACGT↑↓TGCA2.6.4. Визуализация ПЦР продуктов.Наличие продуктов амплификации фрагментов генов ACE, СDH13,MTHFR, CDKN2/BAS и маркера rs11191548 T/C, а также полноту гидролизаПЦР-продуктов генов СDH13, MTHFR, CDKN2/BAS и маркера rs11191548T/C оценивали по результатам электрофореза в 6% полиакриламидном геле,приготовленном на 1x трис-боратном буфере (ТБЕ) в аппарате длявертикального электрофореза, с длной стекла 15-20 см, с последующейокраской этидиумбромидом и визуализацией в проходящем УФ свете.Исходные растворы для приготовления 30% ПААГ на 100 мл водногораствора:29гакриламида(«Sigma»,Германия),1гN,N-метил-бисакриламида («Sigma», Германия); 10x TБE на 500 мл водного раствора: 54г Tris («Serva», Германия”), 27.5г борной кислоты («Serva», Германия), 20 мл0.5 М ЭДTA («Serva», Германия) рН 8.0.Для приготовления 50 мл 6% геля смешивали 10 мл 30% акриламида, 5мл 10х TBE, 35 мл дистиллированной воды, 50 мкл тетраэтилендиамина(«Amresco», США), 500 мкл персульфата аммония («Amresco», США).
Передзаливкой раствор тщательно перемешивали.После амплификации и гидролиза эндонуклеазами рестрикции 10 мклПЦР-продукта непосредственно перед нанесением смешивали с 2 мкл буферадля нанесения проб (состав 6-кратного буфера для нанесения проб: 0,25%бромфенола («Amresco», США) и 0,25% ксиленцианола («Amresco», США),15% фикола («Sigma», Германия) и аккуратно помещали в лунки геля подбуфер.Электрофорез проводили при напряжении 80 вольт в течение первых15 минут. В дальнейшем напряжение увеличивали до 250-300 вольт. Заходом разделения фрагментов следили по миграции красителей (движение137бромфенола в 6% ПААГ эквивалентно миграции фрагмента ДНК размером65 п.о., а ксиленцианола - 260 п.о). Заканчивали электрофорез при выходебромфенола из геля.Гель окрашивали в водном растворе этидиум-бромида (0,5 мкг/мл).РезультатыэлектрофоретическогоразделенияфрагментовДНКрегистрировали при фотографировании геля с помощью видеосистемы «GI2» («Хеликон», Россия), помещенного на трансиллюминатор «TFX-20МС»(«Vilber Lourmat», Франция).
Размеры фрагментов ДНК, выявляенных наПААГ, приведены в таблице 5.Таблица 5. Размеры фрагментов ДНК, выявленных на ПААГ послепроведения ПЦР генов ACE и после ферментативного гидролиза ПЦРпродуктов генов СDH13, MTHFR, CDKN2/BAS и полиморфного маркераrs11191548.ГенИсследуемыйаллельныйвариант/номер rsРазмеры фрагментов(п.н.)АСЕI/Drs4340I – 478D – 191СDH13A/Trs11646213A – 92и 58T – 150MTHFRA/Grs17367504A – 136G – 120CDKN2/BASA/Grs4977574A - 150G – 104 и 46rs11191548T/CT/Crs11191548T – 221С — 115 и 101382.7. Анализ однонуклеотидных замен методом гибридизации на ДНКбиочипе.2.7.1. Выбор праймеров и олигонуклеотидов.Нуклеотидные последовательности праймеров и олигонуклеотидныхзондов выбирали согласно п. 2.6.1. Их нуклеотидные последовательностиприведены в табл.
6, 7, праймеров - в табл. 8, 9, соответственно.Таблица 6. Последовательности олигонуклеотидов для иммобилизациина «Кардиочипе».ГенRENAGTAGTR1AGTR2MTHFRBDKRB2ADRB2Исследуемыйаллельныйвариант/номер rsI9-83G>Ars2368564M235Trs6991166A>Crs51863123C>Ars11091046677C>Trs1801133-58T>Crs179972248A>Grs104271381C>Grs1042714Последовательность 5’-3’CAATGCACAGGTCATGTTAGCAATGCACAGATCATGTTAGAGCTCCCTGATGGGAGCCAGGCTCCCTGACGGGAGCCAGCAAATGAGCATTAGCTACTCAAATGAGCСTTAGCTACTCTTCTTTAAAAACGCTATAAATCTTCTTTAAAAAAGCTATAAATTGCGGGAGCCGATTTCATGCGGGAGTCGATTTCATGACATCATTACCCAGCTGACATCACTACCCAGCGCACCCAATАGAAGCCATGCACCCAATGGAAGCCATGTCACGCAGCAAAGGGACTCACGCAGGAAAGGGACТаблица 7.
Последовательности олигонуклеотидов для иммобилизациина «Фибр-биочипе».ГенFGBF2Исследуемыйаллельныйвариант/номер rs455G>Ars180079020210G>Ars1799963Последовательность 5’-3’GATTTTAATGGCCCCTTTTGTGATTTTAATAGCCCCTTTTGTGACTCTCAGCGAGCCTCAATGTGACTCTCAGCAAGCCTCAATG139F5SERPINE1(PAI1)MTHFRITGB3Таблица1691G>A(Arg506Gln)rs6025–675 5G>4Grs1799768TGGACAGGCGAGGAATACAGCTGGACAGGCAAGGAATACAGGACACGTGGGGAGTCAGCCGACACGTGGGGGAGTCAGC677C>Trs18011331565 Т>С (Leu33Pro)rs5918TGCGGGAGCCGATTTCATGCGGGAGTCGATTTCACCTGCCTCTGGGCTCACCTGCCTCCGGGCTCAC8.Нуклеотидныепоследовательностипраймеровдлямультиплексных ПЦР c последующим анализом методом гибридизации на«Кардиочипе».ГЕНRENAGTAGTR1Исследуемыйаллельныйвариант/номерrsI9-83G>Ars2368564M235Trs6991166A>Crs5186AGTR23123C>Ars11091046MTHFR677C>Trs1801133BKR2-58T>Crs1799722ADRB248A>Grs104271381C>Grs1042714ПРАЙМЕРНазваниепоследовательность 5’-3’Раунд 1RENF1exCTGCTGAGACGTCGTTCCRENR1exTGGAGATGAGGGAACAGGCAGF1exACAAGGTCCTGTCTGCCCTGAGR1exTGCCCATCTCCAAGGCAGR1FexGCAGATATTGTGGACACAGR1Rex CTGGAACTCTCATCTCCTGTTGCAGR2F1exCAGGATTTCCTCTTGAACAGR2R1ex GTGCTTATTCAGAGTTTAGTGAACAMTF1exCCAGTCCCTGTGGTCTCTTCMTR1exATAGGGAGCTTATGGGCTCTBR2F1exTGGCAGAGCGGAGAGCGAABR2R1exGGAAGGAAGGGAACTTTTCCCAACTCADRB2F1exGGCTTCTTCAGAGCACGADRB2R1e ACGCACAGCACATCAATGGAxAGTCРаунд 2140RENI9-83G>Ars2368564AGTM235Trs699AGTR11166A>Crs5186AGTR23123C>Ars11091046MTHFR677C>Trs1801133BKR2-58T>Crs1799722ADRB248A>Grs104271381C>Grs1042714Таблица9.RENF1inRENR1inTATGTATTTCAGGTGAGGTTCGAGTCGCTCCAGGTGACATGCACAAGF1inCTGGATGTTGCTGCTGAGAAAGR1inACCTTGGAAGTGGACGTAGGTGTTGAGR1FinCTGCACCATGTTTTGAGGTTAGR1RinGAAAAAGTCGGTTCAGTCCACATAATGCAR2F1inCAAGACAACATTGTAAGAGAR2R1inAGACTCCACTCAAGTGAAATGCAAGAGGMTF1inTACCCCAAAGGCCACCCCGAMTR1inAGCAATGTCGGTGCATGCCTTCACAABR2F1inCGCAGCCTTCCCGGCCCCACBR2R1inGCGGGAACAGCTCATCTTTCAAGGADRB2F1in CAGTGCGCTTACCTGCCAGAADRB2R1inCGCTGTGATGACCAGCACAНуклеотидныепоследовательностипраймеровдлямультиплексных ПЦР c последующим анализом методом гибридизации на«Фибр-биочипе».ГЕНFGBИсследуемыйаллельныйвариант/номерrs455G>Ars1800790ПРАЙМЕРНазваниепоследовательность 5’-3’Раунд 1FGBF1exTCAATGCACTTACTGGGATTFGBR1exTGGATTACTGCCTCAAAGAGAGATGTGTATCTTGTTTCTG141F220210G>Ars1799963F2F1exF2R1exF51691G>A(Arg506Gln)rs6025F5FexF5RexSERPINE1 (PAI1)–675 5G>4Grs1799768PAIF1exPAIR1exMTHFR677C>Trs1801133MTF1exMTR1exITGB3(GP3a)1565 Т>С(Leu33Pro)rs5918GP3F1exGP3R1exFGB455G>Ars1800790F220210G>Ars1799963F51691G>A(Arg506Gln)rs6025SERPINE1 (PAI1)–675 5G>4Grs1799768MTHFR677C>Trs1801133ITGB31565 Т>С(Leu33Pro)rs5918GATGTGACCTTGAACTTGACTCTATTGGCTCCTGGAACCAATCCCGTGAAAGTCAGGCAGGAACAACACCATGATCACCTTCGGCAGTGATGGTACTGTGGTCCCGTTCAGCCACCTGTGTGTGTGTGTGCTGCTCTGTCCAGTCCCTGTGGTCTCTTCATAGGGAGCTTATGGGCTCTAGGAGGTAGAGAGTCGCCATAAAGAGTCCCAGCCCTACCTРаунд 2FGBF1inCAGCACAAAAAAAGGGTCTTFGBR1inTCTGATGTGGTGGAAACTACACAAGCTCCGAAAGAATAF2F1inGAAGTGGATACAGAAGGTCF2R1inATTGATCAGTGAGTGCTCGGACTACCAGCGTF5FinCCATACTACAGTGACGTGGAF5RinCATCATGCCCCATTATTTAGCCAGGAGACCTAACPAIF1inGTTGTTGACACAAGAGAGCCPAIR1inCTCAGGTCTTTCCCTCATCCCTGCCAMTF1inTACCCCAAAGGCCACCCCGAMTR1inAGCAATGTCGGTGCATGCCTTCACAAGP3F1inGGAGGTAGAGAGTCGCCATGP3R1inAGCTGCACAGTTATCCTTCAGCAGATTCTC1422.7.2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
