Диссертация (1144820), страница 24
Текст из файла (страница 24)
Если в паре положительных сигналовпроба «дикого типа» - «мутантная» проба ни один из сигналов недоминировал,значимымисчиталисигналысобеихячеек,чтосоответствовало гетерозиготному состоянию анализируемого варианта.1482.8. Анализ метилирования остатков цитозина в ДНК.Анализ метилирования остатков цитозина промоторного региона генаH19 в образцах ДНК плаценты проводили с помощью метилчувствительнойили метилспецифичной ПЦР, а также комбинированным бисульфитнорестрикционным анализом.Исследование осуществляли согласно существующим протоколам испециально подобранным олигопраймерам, последовательности которыхприведены в таблице 10.Таблица 10.
Нуклеотидные последовательности праймеров дляпроведения анализа метилирования остатков цитозина в промоторе гена H19.НазваниеметодаМетилчувствительная ПЦРГенПРАЙМЕРназваниепоследовательность 5’-3’AGGTGATGGGGCAATGCTCAGFH19СРайон 1RCCACAAGCTCTCCTCCAGCACGCCATGACAAGTCTCTGAATAALPLFGGAG(отрицательныйGATCACATGAGTCAGGGCAAGRконтроль)CRASSF1(положительныйконтроль)Метилспецифичная ПЦРFCTCATTGAGCTGCGGGAGCTGRCAGATGAAGTCGCCACAGAGGTCFmRmH19район 1FuRuFmRmH19район 2FuRuКомбинироваH19FGAGGGTTTTGTTTTGATTGGTCCTTCCCCTAATTACCCCTCGATGAGGGTTTTGTTTTGATTGGTTGATCTTCCCCTAATTACCCCTCAATGGTTTTATCGTTTGGATGGTACGACGCGTAACTTAAATAACCCGGGTTTTATTGTTTGGATGGTATGCAACACATAACTTAAATAACCCAAAGGGAGGTGATGGGGTAATGTTT149нныйбисульфитнорестрикционный анализРайон 1AGRCTACTCCACACTCCTCACTAACCTFGGGAGGTGATGGGGTAATGTTTAGRCTACTCCACACTCCTCACTAACCTH19Район 22.8.1.
Метилчувствительная ПЦР.Образцы геномной ДНК выделяли из ткани плаценты согласно п. 2.2.3и обрабатывали эндонуклеазами рестрикции «HpaII» и «MspI» («Fermentas»,США). Реакцию проводили при температуре 37оС в течение ночи в 20 мклреакционной смеси, содержащей 3мкл ДНК, 13 мкл дистиллированной воды,2 мкл 10x буфера «Tango» (“Fermentas”, США) и 2 мкл фермента. Раствор сДНК, обработанной эндонуклеазой рестрикции, использовали в качествематрицы при проведении ПЦР.МетодметилчувствительнойПЦРпредполагаетналичиеотрицательного и положительного контроля активности рестриктаз.
Участокгена LPL, не содержащий сайтов для данных эндонуклеаз рестрикции былвзят в качестве отрицательного контроля. Положительным контролемявлялся район гена RASSF1, содержащий CCGG-сайт с метилированнымцитозином(http://www.faqs.org/patents/app/20090155776).последовательностиучастковпромоторныхобластейНуклеотидныесразнойчувствительностью к метилчувствительной эндонуклеазам приведены втаблице 12.Для проведения амплификации генов H19, LPL, RASSF1 готовили трисмеси компанентов следующего состава: 67 мМ Трис-HCl (pH 8,6), 166 мМ150(NH4)2SO4, 0,01% Тритон Х-100, 1,5 мМ MgCl2, 0,2 мМ каждого из dNTP(«Силекс», Россия), 0,4 пМ соответствующих прямого и обратногопраймеров («Бигль», Россия) (см.
табл. 12), и 2,5 единицы активности Taqполимеразы и 1мкл матрицы ДНК. Суммарный объём смеси составил 25 мкл.ДляпроведенияПЦРиспользовалипрограммируемыйтермоциклер«Терцик» («ДНК-технология», Россия). Реакцию проводили в следующемрежиме: денатурация ДНК при температуре 95ºС в течение 5 мин, далее 37циклов амплификации по схеме: денатурация ДНК при температуре 95ºС втечение 30с; отжиг праймеров с матричной ДНК при температуре 60ºС втечение 30с; синтез комплементарной цепочки ДНК при температуре 72ºС втечение 1 мин. Стадия финальной элонгации проходила при температуре72ºС в течение 5мин.Наличие продуктов амплификации последовательностей искомыхгенов анализировали методом ПААГ (как описано в п. 2.6.4).2.8.2.
Метилспецифичная ПЦР.Образцы геномной ДНК обрабатывали бисульфитом натрия (согласноп. 2.3). Далее проводили амплификацию фрагментов геномной ДНК,обработанной бисульфитом натрия. Для проведения ПЦР готовили смесьсостава: 0,2 мМ каждого из dNTP («Силекс», Россия), 0,4 пМ прямого иобратного праймеров («Бигль», Россия) (см. табл. 12), 2,5 единицыактивности «Hot Start» Taq полимеразы («Силекс», Россия), 2,5 мкл буфера«Hot Start Key» («Силекс», Россия) и 1 мкл раствора ДНК.
Суммарный объёмсмесисоставлял25мкл.ДляпроведенияПЦРиспользовалипрограммируемый термоциклер «Терцик» («ДНК-технология», Россия).Реакциюпроводиливследующемрежиме:денатурацияДНКпритемпературе 94ºС в течение 3 мин, далее 37 циклов амплификации последующей схеме: денатурация ДНК при температуре 94ºС в течение 15 с;отжиг праймеров с матричной ДНК при температуре 60ºС в течение 30 с;синтез комплементарной цепочки ДНК при температуре 72ºС в течение 2151мин. Стадия финальной элонгации проходила при температуре 72ºС втечение 5мин.Наличие продуктов амплификации анализировали методом ПААГ (какописано в п. 2.6.4).2.8.3.
Комбинированный бисульфитно-рестрикционный анализ.Образцы геномной ДНК обрабатывали бисульфитом натрия (согласноп. 2.3). Далее, согласно п.2.8.2 проводили амплификацию фрагментовгеномной ДНК, обработанной бисульфитом натрия. После амплификациипродукты ПЦР обрабатывали эндонуклеазой рестрикции «TaqI», для которойв каждой последовательности были установлены сайты рестрикции.Рестрикцию ПЦР продуктов эндонуклеазой «TaqI» («Сибэнзим»)проводили при 65ºС в течение ночи в 15 мкл реакционной смеси,содержащей 5 мкл ДНК, 8 мкл дистиллированной воды, 1,5 мкл 10x буфера«Y+BSA» («Сибэнзим») и 0,5 мкл рестриктазы.
Детекцию продуктовамплификации и продуктов рестрикции анализировали методом ПААГ (какописано в п. 2.6.4).2.9. Массовое параллельное секвенирование ДНК/РНК.2.9.1. NGS секвенирование на приборе «Ion Torrent».2.9.1.1. Создание ДНК-библиотек протяженных фрагментов ДНК методом«удлиняющей» ПЦР.1. Амплификация последовательности гена ACVR2A.На первом этапе проводили амплификацию последовательности генаACVR2A длиной в 89060 п.о. Праймеры, необходимые для амплификации(приведены в табл. 11), подбирали с использованием программы «Oligo 6»(США) как описано в п.
2.6.1, а также с учетом соответствующихрекомендацийпроизводителя«удлиняющей»полимеразы(«Roche»,Швейцария) и данных литературы (Knierim et al., 2011; Hernan et al., 2012).152Таблица 11. Нуклеотидные последовательности праймеров дляамплификации последовательности гена ACVR2A.НомерНазваниеДлинаПоследовательность 5’-3’фрагмента,п.о.1аF-shortR1-new25381F1-newR1-34870F2R28939F3R38825F4R48799F5R58990F6R68821F7R78870F8R888702345678ATATCCTGAGCGGGTGGACAGCCCTTCCTCCGTGAGCCCGTTTCCAAGAGTCCCCCGTAATTCTATGCCACACCTCACGTTTTCTTCAACTTCAGCGTCCAGCAGTGTGGAAGTCTAATGTGGTCCTATCAGCAGCAATAAATACTGGACTACCTCGCACACCCTCTTGGGAATAGTGTTTCCTAGGATGCAAACCCCAGCAGGTAGAAGAGAGGTAGGTTAAGTTCCTAGACTAATCCACAATCCTGTGAGTGTAGAGGCACAAGGCACAAGGGTAGTAAAGAACAATACACGCAGTACCCCCAAGATTATTCTTTTCTGAGAATTATGTCCCTAGGTGCCACACAGTCCAAGCTTCCTAATTTAAACAGTCTACTCACTGTTATTCTGGACATATGCAGATGAAGTATCATCAGTGCCTAGCGAGGGCAGTCTTGTCAAACACTCTGGTTATTCACACTCAGAAAATATAACGGCCTCTTACAAGTCAATCATGGGCCATTTTGCTCTACCACCATCAATATGTGAAGTGTCAAAGAGTCCTTGGGTCAGATTTTTCTATCTACACTCCTGAAAGTATGGAATGGGGCATGGGATGTGAATTTCCTATTTCCTGAACTGCCTCACTTCCCTT1539F9R98923F10R108817F11R1146951011ATGTGTGATTACTTGTTCCCAGGGCCACCTCTGCTACATACACTGCTCTAGCTAGATCCTGGTGTTCTGAAACTAGGGTATAGTAATCTCTAGGATGAGCCAGTTTGGGGAATTCTGGGTAACGACACTTCCTGAGGTGACATGTTTTAAAGCCCCATCTTATATCCAGTTCCCATTCAAACCACCATAACCTAAGTGCTGCCCCATCCTРеакционная смесь для амплификации, объемом 50 мкл, включала: 3-5мкл ДНК-матрицы (70-100 нг/мкл), к которой добавляли деионизованнуюводу, 5 мкл буфера и 0,5 мкл фермента, рекомендованных производителем(«Roche», Швейцария), 300 нМ каждого праймера, 300 мМ каждого dNTP(«Roche», Швейцария).
Для амплификации использовали программируемыйтермоциклер 2720 фирмы «Applied Biosystem» (США).После предварительной денатурации ДНК (3 минуты при 94оС)проводили амплификацию в режиме:- 10 циклов: 940С (25 сек), 550С (15 сек), 680С (11 мин); и 25 циклов: 940С (25сек), 550С (15 сек), 680С (11 мин с удлинением за цикл на 20 сек), 72оС (11мин) – для фрагментов №1, 1а, 4, 6, 11;- 10 циклов: 940С (25 сек), 630С (15 сек), 680С (11 мин); и 25 циклов: 940С (25сек), 630С (15 сек), 680С (11 мин с удлинением за цикл на 20 сек), 72оС (11мин) – для фрагментов №2, 3, 5, 7, 8, 9, 10.НаличиеПЦР-продуктов,необходимыхдлясеквенирования,анализировали в 0,8% геле, приготовленном на 1x трис-боратном буфере(ТБЕ) в аппарате для горизонтального электрофореза («Хеликон», Россия).Исходные растворы для приготовления 0,8% агарозного геля на 100 млводного раствора: 0,8 г агарозы (DNA Grade, «Bio Rad», США), 10 мл10xTБE; 10xTБE на 100 мл водного раствора: 10.8 г Трис («Serva»,154Германия), 5.5 г борной кислоты («Хеликон», Россия), 4 мл 0.5 М ЭДTA(«Serva», Германия) рН 8,0.После амплификации 10 мкл ПЦР-продукта непосредственно переднанесением смешивали с 2 мкл буфера для нанесения проб: 0,25%бромфенола («Amresco», США), 0,25% ксиленцианола («Amresco», США),49,75% глицерола («Amresco», США) и 49,75% дистиллированной воды) иаккуратно помещали в лунки геля под буфер.Электрофорез проводили при напряжении 80 вольт в течение 60 минут.РезультатыэлектрофоретическогоразделенияфрагментовДНКрегистрировали при фотографировании геля с помощью видеосистемы «GI2» («Хеликон», Россия), помещенного на трансиллюминатор «TFX-20МС»(«Vilber Lourmat», Франция).2.
Измерение концентрации ДНК с помощью прибора «Qubit».Навторойстадииподготовкибиблиотекдлясеквенированияпроводили измерения концентрации ПЦР-продукта гена ACVR2A с помощьюприбора «Qubit» («Invitrogen», США), используя набор реагентов «dsDNABRAssayKits»(«Invitrogen»,США)согласнопротоколуфирмыпроизводителя. В случае если полученная концентрация превышаламаксимальное пороговое значение данного набора, делали разведение даннойПЦР пробы и повторно измеряли концентрацию.3. Фрагментация ДНК с помощью«Ion Shear™ Plus Reagents». Очисткафрагментированной ДНК.Дляфрагментациииспользовалиот50до100нгДНК.Фрагментирование ПЦР продукта проводили согласно инструкции «IonXpress™PlusFragmentLibraryKit»кодноименномунабору(«Lifetechnologies», США) при 370С в течение 4-х мин.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
