Диссертация (1144820), страница 25
Текст из файла (страница 25)
После инкубацииреакционную смесь не более 24 часов хранили на льду. Очисткуфрагментированной ДНК проводили, используя «Agencourt® AMPure® XPReagent», согласно инструкции «Ion Xpress™ Plus Fragment Library Kit» ксоответствующему набору («Life technologies», США).1554. Лигирование адаптеров и баркодов, очистка ПЦР-продукта.На четвертой стадии согласно протоколу «Ion Xpress™ Plus FragmentLibrary Kit» («Life technologies», США) осуществляли лигирование адаптерови баркодирование библиотеки, после этого проводили очистку ПЦРпродукта.
ДНК-библиотеку (далее-библиотеку) хранили при температуре 200С.5. Отбор ПЦР-продуктов определенной длины.ПЦР продукты необходимого размера отбирали при электрофорезе вагарозном геле с помощью кассет «E-Gel® SizeSelect™ Agarose Gel»(«Invitrogen», США) на приборе «iBase™ unit» с трансиллюминатором «EGel® Safe Imager™» («Invitrogen», США). Для этого 20 мкл библиотеки(к)загружали в верхнюю(ии) лунку(и) кассеты. В центральную лунку добавляли10 мкл маркера длины «Gene Ruler 50 bp DNA Ladder» («Thermo Scientific»,США) в концентрации 25 нг/мкл.
Для селекции библиотеки длиной 370нуклеотидов электрофорез проводили в течение 15-17 минут согласноинструкции «Ion Xpress™ Plus Fragment Library Kit» к одноименному набору(«Life technologies», США). Пробы нужной длины отбирали не менее двухраз из нижней(их) лунки(ок) кассеты с гелем. Конечный объем отобраннойпробы составлял около 30-40 мкл. После этого проводили очистку ПЦРпродукта согласно вышеуказанному протоколу.6. Амплификация ДНК-библиотеки.Амплификацию библиотеки проводили согласно протоколу «IonXpress™ Plus Fragment Library Kit» («Life technologies», США).
130 мкл ПЦРсмеси включали 100 мкл ПЦР-смеси «Platinum® PCR SuperMix HighFidelity», 5 мкл праймеров «Library Amplification Primer Mix» («Lifetechnologies», США) и 25 мкл «отселектированной» библиотеки.После предварительной денатурации ДНК (5 минут при 95 оС)проводили амплификацию в режиме: 8-10 циклов: 950С (15 сек), 580С (15сек), 700С (1 мин). Для амплификации использовали термоциклер «Verity»(«Life technologies», США).156Далее осуществляли очистку ПЦР-продукта согласно протоколу.7.
Проведение количественной и качественной оценки полученной ДНКбиблиотеки.Количественную и качественную оценку полученной библиотекипроводили на приборе «2200 TapeStation Instrument» («Agilent technologies»,США). Для этого использовали чипы «High Sensitivity D1K ScreenTape» иреактивы «High Sensitivity D1K Reagents» («Agilent technologies», США). К 2мкл библиотеки в микропробирках объемом 0,2 мл, согласно инструкции кнабору, добавляли 2 мкл реагента.
Данную(ые) пробирку(ки) вместе спробиркой, включающей 3 мкл маркера, помещали на станцию. Запускприбора осуществляли согласно инструкции к эксплуатации. Оценкуколичества полученной библиотеки проводили, используя прилагающееся кприбору програмное обеспечение. В последующее исследование бралибиблиотеку концентрацией не менее 1000 пкмол/мкл.Полученную библиотеку(и) разводили до концентрации 26 пкмоль/мклсогласно протоколу «Ion Xpress™ Plus Fragment Library Kit» («Lifetechnologies», США). При последующем одновременном анализе несколькихбаркодированных библиотек проводили их смешивание (объединяли в однумикропробирку объемом 0,2 мкл по 5 мкл каждой библиотеки (в случаечетырех таких библиотек), содержащей 70 млн молекул).
«Разбавленную»библиотеку хранили в при +40С в течение 48 часов, «неразведенную» замораживали до использования при -200С.2.9.1.2. Создание библиотек микроРНК.1. Качественная и количественная оценка библиотеки.Количественную и качественную оценку выделенной микроРНКпроводили на приборе «2200 TapeStation Instrument» («Agilent technologies»,США) и приборе «Qubit» («Invitrogen», США). Для оценки качествабиблиотеки на приборе «2200 TapeStation Instrument» использовали чипы«High Sensitivity R6K Screen Tape» и реактивы «High Sensitivity R6K157Reagents»(«Agilenttechnologies»,США).К2мклмикроРНКвмикропробирках (свободных от РНКаз) объемом 0,2 мл, согласно инструкциик данному набору, добавляли 1 мкл реагента.
Образец денатрурировали притемпературе 720С в течение 3х минут. После этого помещали на лед на 2минуты и центрифугировали в течение 5 сек. После чего переносили настанцию.Запускэксплуатации.прибораОценкуосуществляликачествасогласнополученнойруководствубиблиотекикпроводили,используя прилагающееся к прибору програмное обеспечение. Измеренияконцентрации полученно микроРНК проводили с помощью прибора «Qubit»(«Invitrogen», США), используя набор реагентов «Qubit™ RNA Assay Kits»(«Invitrogen»,США)согласнопротоколуфирмыпроизводителя.Впоследующее исследование брали библиотеку концентрацией от 1 до 100нг/мкл.2. Гибридизация и лигирование РНК.Раствор для гибридизации готовили согласно инструкции к набору «IonTotal RNA-Seq Kit v2» («Life technologies», США).
К раствору (5 мкл)добавляли 3 мкл раствора микроРНК в концентрации от 1 до 100 нг/мкл.Гибридизациюпроводиливстандартныхусловиях(использовалитермоциклер «Verity» («Life technologies», США), далее готовили раствор длялигирования, 12 мкл которого добавляли к гибридизационному раствору.Аккуратно перемещивали, сбрасывали и инкубировали при 160Св течение 16часов на термоциклере «Verity» («Life technologies», США).3. Обратная транскрипция. Очистка и отбор кДНК определенной длины.Обратную транскрипцию проводили согласно протоколу «Ion TotalRNA-Seq Kit v2» («Life technologies», США). Для инкубирования растворовиспользовали термоциклер «Verity» («Life technologies», США). Далееосуществляли очистку и отбор полученной кДНК необходимой длины.4. Амлификация, баркодирование и очистка библиотек микроРНК.Амплификацию библиотеки проводили также согласно протоколу «IonTotalRNA-SeqKitv2»(«Lifetechnologies»,США).К6мкл158«отселектированной» добавляли 46 мкл ПЦР-смеси «Platinum® PCRSuperMix High Fidelity», 1 мкл «Ion Xpress™ RNA 3′ Barcode Primer» и 1 мкл«Ion Xpress™ RNA-Seq Barcode BC primer» («Life technologies», США).После предварительной денатурации ДНК (2 минут при 940С)проводили амплификацию в режиме: 2 цикла: 940С (30 сек), 500С (30 сек),680С (30 сек), 14 циклов: 940С (30 сек), 620С (30 сек), 680С (30 сек),заключительный синтез - 680С (5 мин).
Для амплификации использовалитермоциклер «Verity» («Life technologies», США).Далее осуществляли очистку ПЦР-продукта согласно протоколуданного набора.5. Оценка амплифицированной библиотеки и их подготовка к проведениюэмульсионной ПЦР.Молярную концентрацию баркодированных библиотек определяли,используя чипы «High Sensitivity D1K Screen Tape» и реактивы «HighSensitivity D1K Reagents» с помощью прибора «2200 Tape Station Instrument»(«Agilent technologies», США) (как описано в п. 2.9.1.1. (пп. 7).В последующее исследование брали библиотеку, для которойотношение продуктов лигирования микроРНК к тотальному количествупродуктов лигирования было более 50% (в случае баркодированныхобразцов: [Молярная концентрация области от 94 до 114 п.н] ÷ [Молярнаяконцентрация области от 50 до 300 п.н.]).
При одновременном анализенесколькихбаркодированныхбиблиотекпроводилиихсмешивание,предварительно разведя все образцы до минимальной концентрации(объединяли в одну микропробирку объемом 0,2 мкл). Полученнуюбиблиотеку разводили до концентрации 14 пкмоль/мкл согласно протоколу«Ion Total RNA-Seq Kit v2» («Life technologies», США). «Разбавленную»библиотеку хранили в при +40С в течение 48 часов, «неразведенную» замораживали до использования при -200С.1592.9.1.3.
Эмульсионная ПЦР.Раствор для амплификации готовили из набора реагентов «IonOneTouch™ 200 Template Kit v2 DL» («Life technologies», США), после чего кнему добавляли 20 мкл разбавленной библиотеки. Далее раствор добавляливнутрь специального фильтра «Ion OneTouch™ Plus Reaction Filter» («Lifetechnologies», США), который аккуратно переворачивали и помещали наприбор для эмульсионной ПЦР «Ion OneTouch™ Instrument» («Lifetechnologies», США). Подготовку необходимых реактивов для прибора, егозапуск и последующую очистку осуществляли согласно руководству кэксплуатации.Микросферы отбирали после прохождения эмульсионной ПЦР.
С этойцельюсначала,используя«IonOneTouch™Instrument»,проводилицентрифугирование микроцентрифужных пробирок, затем - удаляли из нихвесь супернатант, кроме 50 мкл на дне пробиркок. Далее обе пробыресуспензировали, объединяли и переносили в новую микропробирку 1,5 млс 1 мл раствора для отмывки «OneTouch™ Wash Solution» («Lifetechnologies», США).
Раствор с микросферами хранили не более трех днейпри температуре +40С.2.9.1.4. «Обогащение» микросфер.«Обогащение» микросфер осуществляли согласно инструкции к наборуреагентов «Ion OneTouch™ 200 Template Kit v2 DL» («Life technologies»,США). Пробирку 1,5 мл, содержащую микросферы, центрифугировали 2,5(3) минуты при 15,500×g (13000×g).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
