Диссертация (1144820), страница 23
Текст из файла (страница 23)
Синтез олигонуклеотидов и изготовление микрочипов.Олигонуклеотиды для иммобилизации на микрочипе синтезировали наавтоматическомBiosystems»,синтезатореСША)с«394DNA/RNAиспользованиемSynthesizer»стандартной(«Appliedфосфоамидитнойпроцедуры. На 3’-конце олигонуклеотидов находился спейсер со свободнойаминогруппой, который вводили при синтезе с помощью «3’-Amino-ModifierC7CPG500»(«GlenResearch»,США).Последовательностьолигонуклеотидов, используемых для иммобилизации в ячейках микрочипа иотсутствие в них примесей посторонних олигонуклеотидов определяли послесинтеза и очистки методом «MALDI TOF MS» (Matrix Assisted LaserDesorption Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry - времяпролетная массспектрометрия с лазерной десорбцией и ионизацией в присутствии матрицы).Анализ проводили на масс-спектрометре «СОМРАСТ MALDI IV» фирмы«KRATOS Analytical» (Великобритания) в линейном режиме с регистрациейотрицательно заряженных ионов с использованием внешней калибровки.
Вкачестве матрицы использовали 3-гидроксипиколиновая кислота («Sigma»,Германия). Измерение масс (m/z) производили с точностью 0.2% измеряемоймассы, что соответствует паспортному значению прибора. Измерениеконцентраций олигонуклеотидов проводили на приборе «Jasco 511» («Jasco»,Япония).Микроматрица биочипа, содержащая ячейки размером около 150 мкм,была приготовлена путем фотополимеризации пористого полиакриламидногогеля. В качестве подложки для нанесения геля использовали «Corning 2947Micro Slides» («Corning Glass Works», США). Стекла предварительнообрабатывали «BindSilane» («Merck», Германия), промывали этанолом идеионизованной водой и высушивали в беспылевых условиях. Смесьолигонуклеотидов и мономеров геля добавляли в микротитровальнуюплашку.
Последовательное нанесение ячеек геля на стекло проводили сиспользованием 200, 300 и 600 мкм игл при помощи «Affymetrix GMS 417Arrayer» («Affymetrix», США). В зависимости от целей эксперимента143использовали различные составы геля. Как правило, использовали составсмеси, содержащий 4% акриламид («Sigma», Германия), 0.25 % N,N’-метиленбис-акриламид («Sigma», США), 65% глицерин и модифицированныйолигонуклеотид (400 – 4000 пмоль/мкл).
По окончании нанесения микрочипывыдерживали 12-18 часов под аргоном, проводили фотополимеризацию втечение 40-50 минут (312 нм) при комнатной температуре и отмывали в водепри 65°С в течение 30 минут. Контроль качества нанесения осуществлялся спомощьюспециализированнойоптикиикомпьютерногоанализаизображения. Система контроля состояла из двух этапов:1. Визуальный контроль физических размеров гелевых ячеек припомощи светового микроскопа в отраженном свете, который позволялпроводитьотбраковкубиочиповснеровными,поврежденнымиизагрязненными гелевыми ячейками.2.
Контроль концентрации иммобилизованных олигонуклеотидов спомощью красителя «SYBR® Green ІІ» («Molecular Probes», США).Дляопределенияолигонуклеотидовразбросабиочиповоднойконцентрацийпартиинаиммобилизованныхмикрочипнаносилиоднократный раствор «SYBR® Green ІІ» и инкубировали при комнатнойтемпературе 10-15 мин. После этого биочип с нанесенным на него растворомкрасителя помещали в камеру флуоресцентного микроскопа и измерялифлуоресцентный сигнал для каждой ячейки.Концентрация олигонуклеотидов в полученных ячейках составляла от200 до 4500 пмоль/мкл.
Диаметр капель составлял приблизительно 150 мкм,расстояние между ними было около 350 мкм. Объем каждой капли был равенпримерно 0,2 нл.2.7.3.АмплификацияфрагментовДНКдляанализаметодомгибридизации на олигонуклеотидном биочипе.C целью амплификации гены всех биочипов объединяли в группы,соответствующие блокам олигонуклеотидных проб на биочипе.144В группу 1 (блок 1) «Кардиочипа» вошли следующие гены: REN (I983G>A), AGT (M235T), AGTR1 (1166A>C) и AGTR2 (3123C>A), в группу 2(блок 2) - MTHFR (677C>T), BKR2 (-58T>C) и ADRB2 (48A>G и 81C>G). Напервой и на второй стадии мультиплексной ПЦР амплифицировалифрагменты генов, входящие как в блоки 1, так и в блок 2.Все гены «Фибр-биочипа» были объединены в одну группу, кудавошли гены MTHFR (677C>T), F5 (1691G>A), ITGB3 (1565C>T), SERPINE1(–675 5G>4G), FGB (-455G>A), F2 (20210G>A).
Амплификацию всехфрагментов генов проводили в две стадии.Реакционная смесь (25 мкл) для каждого блока всех биочипов напервом этапе ПЦР содержала 0.4 пмоля каждого праймера, 67 мМ Трис-HCl(pH 8.6), 166 мМ (NH4)2SO4, 0.01% Тритон Х-100, 1.5 мМ MgCl2, 0.2 мМкаждого из dNTP («Силекс», Россия) и 2.5 ед. акт.
Taq-полимеразы («Силекс»или «Бигль», Россия). Для амплификации использовали программируемыйтермоциклер «Termocycler 1» («Biometra», США), амплификатор «MYCycler» («BioRad», США). Реакцию проводили в следующем режиме:денатурация при 940С (5 мин), далее 35 циклов амплификации по следующейсхеме: 940С, 30 с; 600С, 30 с; 720С, 1 мин.Продукт первого этапа ПЦР (1 мкл) использовали в качестве матрицына втором этапе ПЦР, который проводили в реакционной смеси того жесостава, но добавляли по 4 пмоля флуоресцентно меченных праймеров(обратный праймер второго раунда), чтобы получить избыток флуоресцентномеченного одноцепочечного ПЦР-продукта.
После денатурации в течение 5мин при 940С проводили 35 циклов амплификации по следующей схеме:940С, 30 с; 620С, 30 с; 720С, 1 мин; далее 72оС, 5 мин.2.7.4. Визуализация ПЦР-продуктов в агарозном геле.НаличиеПЦРпродуктов,необходимыхдлягибридизациинаолигонуклеотидном биочипе анализировали в 2% геле, приготовленном на 1x145трис-ацетатномбуфере(ТАЕ)ваппаратедлягоризонтальногоэлектрофореза.Исходные растворы для приготовления 2% агарозного геля на 100 млводного раствора: 2 г агарозы (DNA Grade, «Bio Rad», США), 2 мл 50xTAE;50xTAE на 100 мл водного раствора: 24,2 г Триса («Serva», Германия), 5,7 млледяной уксусной кислоты, 10 мл 0,5 М ЭДTA («Serva», Германия) рН 8,0.После амплификации 10 мкл ПЦР продукта непосредственно переднанесением смешивали с 2 мкл буфера для нанесения проб (состав 6кратного буфера для нанесения проб: 0,25% бромфенола («Amresco», США)и 15% фикола («Sigma», Германия) и аккуратно помещали в лунки геля подбуфер.Электрофорез проводили при напряжении 170 вольт в течение 20минут.
Результаты электрофоретического разделения фрагментов ДНКрегистрировали при фотографировании геля с помощью видеосистемы «GI2» («Хеликон», Россия), помещенного на трансиллюминатор «TFX-20МС»(«Vilber Lourmat», Франция).2.7.5. Гибридизация меченого продукта на биочипеГибридизациюфлуоресцентнонамеченыхмикрочипахобразцов,проводилиполученныхснаиспользованиемвторойстадиимультиплексной ПЦР, в 32 мкл смеси следующего состава: 8 мкл формамида(«Serva», Германия), 8 мкл 20х SSPE («Promega», США) и по 8 мкл длякаждого из блоков – в случае анализа генов «Кардиочипа» и 16 мкл образца в случае анализа генов «Фибр-биочипа»).
Гибридизационную смесьденатурировали при 950С (5 мин), охлаждали на льду (3 мин), наносили набиочип и оставляли на ночь при температуре 370С. Далее чип отмывали в 1xSSPE в течение 5 мин при 200С и высушивали.1462.7.6. Регистрация изображения на биочипе и его обработка.Флуоресцентный сигнал от ячеек каждого микрочипа регистрировали спомощью широкопольного люминесцентного микроскопа, снабженногокамерой ПЗС и программным обеспечением «Imageware» («Биочип-ИМБ»,Россия) (рис. 13).Рисунок 13. Интерфейс программы «ImageWare» для «Кардиочипа».При анализе полученных данных использовали нормированныесигналы флуоресценции Jm = (Im – I0)/(Bm – I0), где Im - интенсивностьсигнала на единицу площади внутренней части соответствующей ячейки, Bm– фоновый сигнал, отражающий распределение освещенности микрочипа, I0– темновой ток ПЗС матрицы, а m – номер ячейки чипа (например, m = 1, ...
,56).Анализпроводили следующим образом. При анализе интенсивностифлуоресценции использовали среднее значение между двумя дублирующими147ячейками. Сигналы Jm сортировали по возрастанию и строили гистограмму(рис. 14).Рисунок 14. Значения нормированных сигналов флуоресценции с ячеек«биочипа». Ячейки 1-25 имеют значения флуоресценции, сравнимые сфоном. Ячейка 26 - ячейка сравнения. Ячейки 27 и далее показываютзначимый сигнал флуоресценции по отношению к фону.Ячейкой сравнения считали ячейку, после которой на графикенаблюдали резкое увеличение нормированного сигнала. Считали, что ячейкаимеет положительный сигнал, если ее сигнал превышал сигнал ячейкисравнения.Затемсравнивалимеждусобойячейки,содержащиенуклеотидную последовательность «дикого типа» и соответствующую«мутантную» последовательность, выявляя доминирующий сигнал, которыйпревышал пороговое значение.Пороговое значение сигнала определили статистически, обработавболее 100 гибридизационных картин.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
