Диссертация (1144752), страница 25
Текст из файла (страница 25)
На основании этого возникает вопрос, как взаимодействуютмежду собой компоненты сигнального пути, активируемые Nod-факторами ифитогормонами, а также каким образом осуществляется передача сигнала отNod-фактора в клетки корня с участием фитогормонов.Роль цитокининов и ауксинов в развитии симбиотических клубеньковЭкспериментальные данные указывают на важную роль цитокининов иауксинов в регуляции процесса формирования клубеньков, что былоотмечено нами в главе «Обзор литературы» (Libbenga et al. 1973; GonzalezRizzo et al., 2006; Tirichine et al., 2007; Rightmyer and Long, 2011; Heckmann etal., 2011; Plet et al., 2011, Ferguson and Mathesius 2014).
Наиболее важнымдоказательством участия цитокининов явилось получение мутантов cre1 иlhk1 с выключением функции генов MtCRE1 и LjHK1, кодирующих рецепторк цитокининам, у которых наблюдали значительное снижение количестваформирующихсясимбиотическихклубеньков.Напротив,мутации,вызывающие спонтанную активацию рецептора к цитокининам MtCRE1/LjLHK1 (доминантно позитивная мутация в гене рецептора), приводили кразвитиюклубенько-подобныхструктур(спонтанныхклубеньков),формирующихся в отсутствии ризобий. При этом экспрессия активируемыхцитокининами генов первичного ответа А-типа (type-A Response Regulators,RR A-типа) значительно возрастает при инокуляции, что указывает на то, чтоцитокининовый ответ является частью сигнального каскада, активируемогоризобиями (Gonzalez-Rizzo et al., 2006; Op den Camp et al., 2011; Plet et al.,1562011).
В соответствии с этим цитокинины активируют экспрессию генов,кодирующих транскрипционные регуляторы, такие как NSP1, NSP2, ERN1 иNIN (Plet et al., 2011).Ранее мы отмечали, что важную роль в контроле клубенькообразованияиграют также и ауксины. При этом Nod-факторы оказывают влияние набалансауксиновврастенииприклубенькообразовании,активируяингибиторы ПАТ.
Действительно, в ранних работах с использованиемгенетических конструкций, содержащих ауксин-регулируемые промоторыGH3::GUS, DR5::GUS, слитые с репортерными генами, было показано, чтоауксины непосредственно влияют на закладку примордиев клубеньков убобовых растений (Mathesius et al., 1998; Huo et al., 2006). При этом убобовых, формирующих недетерминированные клубеньки (Trifolium repens,Medicago truncatula), нарушается ПАТ и ауксины накапливаются в местеинокуляции ризобиями. Результатом этого может являться перенаправлениепотока ауксинов в клетки эндодермы и паренхимы, что локальностимулирует пролиферацию клеток.Причиной ингибирования ПАТ в месте инфекции может бытьнакопление флавоноидов, синтез которых активируется под влиянием Nodфакторов (Wasson et al., 2006; Mathesius, 2008). Вместе с тем, на транспортауксинов могут оказывать влияние цитокинины.
Было показано, чтоэкспрессия некоторых генов MtPIN, кодирующих белки-переносчикиауксинов, увеличена у мутантов cre1 М. truncatula, по сравнению с дикимтипом (Plet et al., 2011; Xiao et al., 2014). Это позволяет предположить, чтоцитокинины могут влиять на накопление ауксинов посредством подавленияэкспрессии генов PIN (Plet et al., 2011).У бобовых растений, формирующих детерминированные клубеньки (L.japonicus), ингибирование ПАТ не наблюдается, но в месте закладкиклубеньков возрастает концентрация ауксинов, что было показано вэкспериментах с ауксин-регулируемыми конструкциями (Pacios-Bras et al.,1572003; Subramanian et al., 2006).
При этом увеличение содержания ауксиновкоррелировалосиндукциейэкспрессиигенаTRYPTOPHANAMINOTRANSFERASE RELATED1 (TAR1), контролирующего биосинтезауксинов (Suzaki et al., 2012).Все эти данные убедительно свидетельствуют о том, что и цитокининыи ауксины играют важную роль в развитии симбиоза, но их роль ещенедостаточно изучена при клубенькообразовании у бобовых растений.
Приэтомзначительныйосуществляетсяинтереспредставляеткоординированнаярегуляцияисследованиетого,органогенеза,каккотораяпозволяет экзогенным сигналам Nod-факторам активировать эндогенныерегуляторы самого растения – фитогормоны и транскрипционные факторы.Важным является и вопрос о том, что определяет изменение содержаниягормонов в процессе развития симбиоза – является ли это результатомсинтеза, перехода гормонов из неактивной формы в активную илирезультатом активации транспорта гормонов у растений. Изучению этихвопросов был посвящен данный раздел исследований.Задачами данного раздела исследований являлись:1.Локализация ответа растений гороха на цитокинины и ауксины спомощью цитокинин- и ауксин-регулируемых репортерных конструкцийpRR4::GUS и DR5::GFP.2.Поиск у гороха генов первичного ответа на цитокинины (RR А- и Bтипа), а также генов, контролирующих биосинтез цитокининов и ихпереход в активное состояние (IPT и LOG), экспрессия которыхвозрастает при развитии симбиоза.3.Идентификация генов гороха, контролирующих биосинтез (TAR) итранспорт ауксинов (PIN) и активирующихся в процессе развитиясимбиоза.1584.Анализ содержания различных форм цитокининов и ауксинов угороха при клубенькообразовании.5.Анализ взаимодействия между компонентами сигнального каскада,активируемого Nod-факторами и регуляторами фитогормональногоответа.3.1.
Локализация ответа растений гороха на цитокинины и ауксины спомощьюцитокинин-иауксин-регулируемыхрепортерныхконструкций pRR4::GUS и DR5::GFP.Для изучения влияния фитогормонов цитокининов и ауксинов наразвитие клубеньков у гороха были получены трансгенные растения,содержащие генетические конструкции с промоторами цитокинин- и ауксинрегулируемых генов (DR5::GFP-NLS, pRR4::GUS), и проведен их анализ. Утрансгенных растений гороха линии SGE, содержащих конструкциюDR5::GFP-NLS (NLS – сигнал ядерной локализации), ответ на ауксинынаблюдался на ранних этапах развития клубеньков в делящихся клеткахперицикла, эндодермы и внутренней коры корня (рисунки 46 а). Всформированном клубеньке ответ на ауксины был ограничен главнымобразом периферической зоной клубенька – меристемой, проводящимипучками и корой клубенька (рисунки 46 б).Анализ трансгенных растений, содержащих конструкцию pRR4::GUS спромотором цитокинин-регулируемого гена, выявил ответ на цитокинины вформирующихся примордиях клубеньков (в перицикле, эндодерме и коре).
Всформированном клубеньке GUS-окрашивание было выявлено в меристеме(I), зоне заражения (II) и начале зоны азотфиксации (III) (рисунок 47), чтопредполагает участие цитокининов не тольков регуляции развитиямеристемы клубеньков, но и контроле более поздних этапов развитияклубеньков,связанныхсразвитием159инфекционногопроцессаидифференцировкой тканей клубенька. В пользу предположения об участиицитокининоввконтроледифференцировкитканейклубенькасвидетельствуют и данные по изучению у бобового растения со сходнымтипом клубенькообразования M. truncatula мутанта по рецептору кцитокининам cre1, у которого в редких образующихся клубеньках быласущественно нарушена зональность (Plet et al., 2011).Для того, чтобы ответить на вопрос о том, что могло лежать в основеизменений содержания гормонов в процессе развития клубенька, нами былпроведен поиск и анализ экспрессии генов, вовлеченных в ответ растений надействие цитокининов и ауксинов, а также контролирующих метаболизмэтих гормонов.Рисунок 46 а.
Локализация ответа на ауксины в развивающихсяпримордиях гороха дикого типа SGE, содержащих ауксин-регулируемуюконструкцию DR5::GFP-NLS.160Рисунок 46 б. Локализация ответа на ауксины в меристеме клубеньковгорохадикоготипаSGE,содержащихауксин-регулируемуюконструкцию DR5::GFP-NLS.IIIII-IIIIIIIVРисунок 47. Локализация ответа на цитокинины в развивающихсяпримордиях и клубеньках растений гороха дикого типа SGE (14 дпи) спомощьюцитокинин-регулируемойконструкцииpRR4::GUS.Обозначения: I – меристема, II – зона заражения, интерзона II-III, III – зонаазотфиксации, IV – зона старения, vb – проводящие пучки.3.2. Поиск у гороха генов первичного ответа на цитокинины (RR А- и Bтипа), а также генов, контролирующих биосинтез цитокининов и ихпереход в активное состояние (IPT и LOG), экспрессия которыхвозрастает при развитии симбиоза.3.2.1.
Выявление и анализ экспрессии генов гороха, активация которыхпроисходит при рецепции растениями фитогормонов цитокининов(регуляторов первичного ответа гороха на цитокинины).161Рецептор к цитокининам активирует регуляторы ответа (от англ.response regulators) RR B-типа - транскрипционные факторы, которые имеютДНК-связывающий домен и могут напрямую регулировать гены первичногоответа на цитокинины.
Среди генов первичного ответа на цитокинины − геныRR A-типа, которые действуют как негативные регуляторы действияцитокининов (Heyl and Schmülling, 2003).У модельного бобового M. truncatula в ответ на инокуляциюиндуцируется экспрессия нескольких генов, кодирующих RR B-типа ирегуляторы первичного ответа RR A -типа (Gonzalez-Rizzo et al., 2006; Loharet al., 2006; Plet et al., 2011). В геноме M.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
