Диссертация (1144752), страница 20
Текст из файла (страница 20)
Схема конструирования векторов для трансформациирастений pBIN19::p35S::Sym10-YFP и pBIN19::p35S::Sym37-RFP.1191.2.2.1. Синтез полноразмерных белков-рецепторов Sym10 и Sym37 влистьях N. benthamiana.В результате выполненных исследований было показано, что синтезбелков-рецепторов Sym10 и Sym37 может достигать высокого уровня влистьях N. benthamiana. Максимальный уровень накопления белков в такойсистеме наблюдали через 48 часов после инфильтрации в листьяAgrobacterium tumefaciens, содержащих генетические конструкции длянаработки белков.
Установлено, что белки доставляются и встраиваются вплазматическую мембрану, поскольку нами было выявлено свечениефлюоресцирующих белков Sym10-YFP/ Sym10-RFP (yellow/ red fluorescentprotein) и Sym37-YFP/ Sym37-RFP в мембране клеток листьев N. benthamiana(рисунок 29). Это соответствует представлению о том, что белки Sym10 иSym37 являются интегральными трансмембранными рецепторами у гороха P.sativum.Рисунок 29. Локализация полноразмерных белков Sym10-RFP и Sym37YFP в листьях N.
benthamiana (Kirienko et al., 2016). О синтезе белков в клеткахсудили по флуоресцентному свечению YFP/RFP в мембране клеток N. benthamiana.Синтез в листьях двух белков Sym10 и Sym37, содержащих в своемсоставе последовательность 3xFLAG, позволил выявить накапливающиесябелки с помощью антител против этой группы. Вестерн-блот анализ120выделенных белков с использованием антител против FLAG показал, чтосинтезируемый в N. benthamiana белок гороха Sym10 имеет молекулярнуюмассу около 80 кДа, а белок Sym37 – около 70 кДа (рисунок 30).Рисунок 30.
Вестерн-блот анализ экспрессии белков Sym10-FLAG, NFPFLAG, Sym37-FLAG и LYK3-FLAG в листьях N. benthamiana сиспользованием антител против 3xFLAG.Это несколько превышает их ожидаемые размеры на основаниианализа последовательностей аминокислот (66 и 68 кДа, соответственно).Различия в молекулярной массе ожидаемой и выявленной в нашихэкспериментах могут быть связаны с гликозилированием белка.
Наличиешести таких сайтов для гликозилирования было определено на основаниианализа структуры белка Sym10, тогда как для белка Sym37 было выявленочетыре таких сайта с помощью доступных баз данных сетевых сервисов,содержащих данные о структуре и функциях белков (NetNGlyc 1.0 Serverhttp://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/). Следует отметить, что ранее длярецептора NFP M.
truncatula (гомолог Sym10) и рецептора LYK3 (гомологSym37) были также показаны высокие уровни гликозилирования (присравнении размеров белков до и после обработки гликозидазами) (Mulder etal., 2006). На основании этого мы полагаем, что белки Sym10 и Sym37являются гликозилированными у гороха. Таким образом, при экспрессии в121листьях N. benthamiana нам удалось получить рецепторы с необходимымиспецифичными для растений модификациями.1.2.2.2.Изучениесвязывающейспособностисинтезированныхврастениях полноразмерных рецепторов с Nod-факторами.Следующей задачей наших исследований была оценка связывающейспособности полноразмерных LysM-РПК Sym10 и Sym37, синтезированных влистьях N. benthamiana, с Nod-факторами. Наиболее надежным методомизучения связывающей способности рецепторов с лигандами являетсярадиорецепторный метод, позволяющий точно рассчитать аффинность белкарецептора (Варфоломеев, Гуревич, 1998).
При синтезе в листьях N.benthamiana под высокоэффективным промотором 35S было выявленовысокое содержание белков-рецепторов в плазматической мембране клеток(рисунок 31). Для анализа связывания с Nod-факторами была выделена изтрансформированныхлистьевмикросомальнаясубклеточнаяфракция(осадок, полученный при дифференциальном центрифугировании при100 000g, о присутствии рекомбинантных рецепторных белков в этойфракции судили по флюресцентному свечению).
Важно при этом, что белкинаходятся в мембране, то есть в «естественном окружении» и, следовательно,условия для оценки связывающей способности с лигандом для изучаемыхбелков близки к нативным.В нашем распоряжении не было радиоактивно-меченных Nod-факторовRhizobium leguminosarum bv. viciae - NodRlv- VI, V, Ac, C18:4. Однако коллегииз лаборатории растительно-микробных взаимодействий (INRA, г. Тулуза,Франция) предоставили нам для анализа связывания близкие по строениюрадиоактивно-меченные Nod-факторы Sinorhizobium meliloti -35S-NodSm-VI,Ac, S, C16:2. Коровая структура двух типов Nod-факторов сходная, наневосстанавливающем конце молекулы присутствует в обоих случаях ацетил122(Ас), но молекулы отличаются по строению жирной кислоты и наличиюзаместителя на редуцирующем конце Nod-фактора (есть сульфат в Nodфакторах S.
meliloti, тогда как в Nod-факторах Rh. leguminosarum bv. viciaeзаместителя на редуцирующем конце нет). Неспецифическое связываниебыло определено в присутствии высоких концентраций (2 мкМ) «холодного»NodSm-IV (S, Ac, C16:2). Так как нами были использованы Nod-факторы S.meliloti (симбионта люцерны посевной M. sativa и люцерны слабоусеченнойM. truncatula), было также проведено сравнение связывающей способностигомологичных рецепторов NFP и LYK3 M. truncatula (внеклеточныхдоменов), синтезированных в сходных условиях в бактериях E. coli, с35S-NodSm-IV, Ac, S, C16:2.Рисунок 31. Анализ связывающей способности рецепторов Sym10 и NFPc 35S-NodSm-IV,Ac, S, C16:2.Однако проведенный эксперимент вновь выявил достаточно низкиезначения специфического связывания с NodSm-IV (S, Ac, C16:2) для рецепторподобных киназ Sym10 и Sym37, а также для контрольных белков NFP иLYK3 (рисунок 31). Это не позволило точно рассчитать Kd для рецепторовSym10 и Sym37 гороха, а также NFP и LYK3 M.
truncatula. Таким образом,полноразмерные рецепторы Sym10 и Sym37 не обладали более высокой123аффинностью к Nod-факторам по сравнению с редуцированными формамирецепторов (внеклеточных доменов), синтезированными в клетках E. coli.В целом на основании проведенного нами анализа связывающейспособности рецепторов Sym10 и Sym37, синтезированных в гетерологичныхсистемах, можно сделать вывод об их низкой аффинности к Nod-факторам.Однако анализ мутантов по этим генам свидетельствует о необходимостиэтих рецепторных киназ для инициации симбиоза (Madsen et al., 2003;Zhukov et al., 2008). Возможным объяснением этих данных может бытьспособность рецепторов связывать Nod-факторы с высокой аффинностьютолько при формировании гомо- или гетероолигомерных комплексов.
Впользунеобходимостиформированиягомо-илигетероолигомерныхкомплексов рецепторов при связывании лиганда свидетельствуют и данныепо изучению других представителей класса LysM-рецепторов. В частности,было показано, что LysM-рецептор этого класса, CERK1 арабидопсиса,связывает лиганд (олигомер хитина (n = 8)) только при образованиигомоолигомерного комплекса AtCERK1/AtCERK1 или гетероолигомерногокомплекса с другим LysM-рецептором LYK5 - AtCERK1/AtLYK5 (Liu et al.,2012; Cao et al., 2014). С другой стороны, выделяемые ризобиями Nodфакторы быстро гидролизуются ферментами бобовых растений до димеров итримеров (Ovtsyna et al., 2005). Нельзя исключить, что лигандом длярецепторов могут быть продукты расщепления Nod-факторов.
Наконец, всоставе рецепторного комплекса могут быть дополнительные белки свысокой аффинностью к Nod-факторам, а Sym10 и Sym37 необходимы дляформирования комплексов с этими белками. В пользу этого предположениясвидетельствуютэкспериментысрецепторамиCERK1иLYK5уарабидопсиса (Cao et al., 2014). Сравнительный анализ показал низкуюаффинность к хитоолигосахаридам рецептора CERK1, который был открытпервым (Lie et al., 2012). Однако в дальнейшем был выявлен новый рецепторLYK5 с высокой аффинностью к хитоолигосахаридам, который формирует124комплекс с CERK1 (Cao et al., 2014). В связи с этим на следующем этапеисследований перед нами стояла задача выявить дополнительные рецепторык Nod-факторам у гороха, а также выяснить, как могут функционироватьLysM-рецепторы в процессе передачи сигнала от Nod-фактора.1.3. Выявление новых кандидатов на роль рецепторов к Nod-факторам угороха и оценка их способности контролировать развитие симбиоза.(Результаты исследований, представленные в разделах 1.3, 1.4 и 1.5, былиполучены совместно с аспиранткой ФГБНУ ВНИИСХМ Кириенко АннойНиколаевной,руководствокандидатскойдиссертациейкоторойосуществлено автором настоящего диссертационного исследования).1.3.1 Компьютерное моделирование связывания LysM-РПК К1 c Nodфакторами Rh.
leguminosarum bv. viciae NodRlv-V, C18:4, Ac.Других мутантов, кроме sym10 и sym37, у гороха выявлено не было.Однако скрининг библиотеки кДНК клубеньков гороха позволил выделитьген PsK1, который показал высокую степень гомологии с геном PsSym37(Zhukov et al., 2008). Это означает, что K1 является LysM-РПК сполноценным киназным доменом у гороха и указывает на возможное участиеK1 в узнавании Nod-факторов. Следующая часть нашей работы былапосвящена проверке данной гипотезы.В пользу предположения о том, что K1 может быть дополнительнымрецептором к Nod-факторам у гороха, свидетельствуют и данные о строениикиназного домена у этого белка, в котором присутствует характерная длясимбиотических рецепторов последовательность YAQ (Nakagawa et al.,2011).
Данные о функциональной роли последовательности YAQ в активациисимбиотических реакций уже были проанализированы в главе «Обзорлитературы». В геноме модельного бобового растения M. truncatula было125выявлено 17 членов семейства LysM-РПК LYK, среди них имели участокYAQ в киназном домене только четыре – LYK3 и LYK2, расположенные втак называемом кластере LYK генов на хромосоме 5, а также LYK8 и LYK9(расположенные на хромосоме 3) (база данных NCBI).
Интересно, что LYK2и LYK3 показывают наиболее высокую степень гомологии с рецептором K1гороха. Это давало нам дополнительное основание для того, чтобы изучитьболее детально роль рецептора K1 в симбиозе.Удобным подходом для выяснения функции рецептора может бытькомпьютерное моделирование его связывания с возможным лигандом(докинг). В связи с этим нами была построена модель взаимодействия белкарецептора К1 с основным Nod-фактором, выделяемым бактериями Rh.leguminosarum bv. viciae NodRlv-V, C18:4, Ac.Пространственную модель полного внеклеточного домена LysM-РПКК1 проводили с использованием информации о трехмерной (3D) структуререцептор-подобной киназы CERK1 A. thaliana (Protein Data Bank, код 4EBZ),для которой был проведен рентгеноструктурный анализ кристаллизованноговнеклеточного домена с лигандом – олигомером хитина (n=8).
Достаточновысокий уровень гомологии между последовательностями анализируемыхLysM1, LysM2 и LysM3 доменов К1 и соответствующих доменов AtCERK1(уровень гомологии 33%, 54% и 65% между доменами), позволил примоделировании использовать в качестве шаблона эту LysM-РПК A. thaliana.Крометого,былаиспользованаинформацияоконсервативныхдисульфидных связях в трехмерной структуре белка К1 (между остаткамицистеина C2-C68, C6-C130 и C66-C128). Было показано, что все три LysMдомена К1 - LysM1, LysM2 и LysM3 - имеют сходную структуру,представленную двумя β-слоями и двумя α-спиралями – β1α1α2β2.ПолученнуюсмоделированнуюструктурувнеклеточногодоменаК1использовали для поиска сайтов связывания в белковой молекуле с126потенциальным лигандом Nod-фактором с помощью молекулярного докинга,реализованного в программе Schrödinger.Нарисунке32показанрезультатмоделированиясвязываниявнеклеточного домена LysM-РПК K1 гороха сорта Finale с NodRlv-V, C18:4,Ac.
Наиболее энергетически предпочтительная модель указывает навозможность укладывания остова Nod-фактора в междоменную бороздумежду LysM1 и LysM3 внеклеточного домена К1 (Kirienko et al., 2016).Между остовом Nod-фактора и белковой молекулой формируется 8водородных связей с использованием гидроксилов первого и второго колецN-ацетилглюкозаминас аминокислотамиN61 и K45,второго и четвертого кольца с аминокислотамиаминогруппамиR59 и Y57, а такжегидроксилом и аминогруппой третьего кольца с E159 и кислородом междутретьим и четвертым кольцами и аминокислотой K155 (рисунок 32).Водороднаясвязьтакжеобразуетсямеждуацетиломнаневосстанавливающем конце Nod-фактора и аминокислотой R188 (рисунок 32).Моделирование показало, что жирная кислота Nod-фактора лежит внемеждоменной борозды.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
