Диссертация (1144752), страница 21
Текст из файла (страница 21)
Следовательно, на основании проведенного анализаможно сделать вывод о том, что К1 может являться рецептором к Nodфакторам у гороха, при этом этот рецептор может проявлять специфичностьв отношении связывания лиганда.Рисунок 32. Математическое моделирование связывания внеклеточногодомена рецептора К1 с NodRlv-V, Ac, C18:4 Rh. leguminosarum bv. viciae127(Kirienko et al., 2016).Ранее молекулярный докинг связывания с лигандом был сделан дляотдельных LysM доменов и полных внеклеточных доменов LysM-РПК NFR5L.
japonicus и NFP M. truncatula, которые являются гомологами Sym10 P.sativum (Mulder et al., 2006; Radutoiu et al., 2007; Lefebvre et al. 2012;Fliegmann et al., 2013) с использованием в качестве шаблона какбактериальной LysM-содержащей мембранной муреин трансгликозидазы D,так и LysM-РПК AtCERK1. Однако в случае этих рецепторов была показанавозможность укладывания остова Nod-фактора в борозду, сформированную вLysM2 домене этих рецепторов α2-спиралью и β2-слоем (Mulder et al., 2006;Radutoiu et al., 2007; Lefebvre et al.
2012; Fliegmann et al., 2013). Нами впервыебыла построена модель связывания Nod-фактора с рецептором K1, которыйможет быть необходим для передачи сигнала внутри клетки. В результатебыли получены данные о том, что Nod-фактор может являться лигандом дляК1 LysM-РПК.1.3.2. Синтез внеклеточного домена рецептор-подобной киназы К1 вбактериях E. coli и анализ связывания с NodRlv-IV, V, C18:4, Ac.(Результаты исследований, представленные в разделе 1.3.2, были полученысовместно со студенткой СПбГУ Ковалевой Оксаной Дмитриевной,руководство магистерской диссертацией которой осуществлено авторомнастоящего диссертационного исследования).Для проверки связывающей способности LysM-РПК К1 с Nodфакторами был осуществлен синтез внеклеточного домена этого рецептора вбактериях E.
coli. Синтез был осуществлен в условиях, ранее разработанныхдля белков Sym10 и Sym37. Очистку внеклеточного домена K1-ECDпроводили с помощью металлохелатной аффинной хроматографии. Анализ128связывающей способности K1-ECD с Nod-факторами с помощью методаповерхностного плазмонного резонанса позволил выявить Kd = 1,29 х 10-8 ±0,51 (рисунок 33). Таким образом, для рецептора К1 гороха нами былапоказана способность связывать Nod-факторы.Рисунок 33. Анализ связывания внеклеточного домена рецептора К1ECD с Nod-IV, V, C18:4, Ac с помощью метода поверхностногоплазмонного резонанса.1.4.1.
Фенотипический анализ мутантов по гену k1 у гороха.Для доказательства участия LysM-РПК К1 в контроле развития симбиозаиз коллекции TILLING мутантов были изолированы два мутанта по гену k1.Анализ мутантных линий 885 (замена G332D332 в активационной петлекиназного домена) и 817 (замена Р146 S146 в LysM3-мотиве внеклеточногодомена) показал, что в ответ на инокуляцию у них блокируется развитиесимбиоза (Nod- фенотип) (рисунок 34).
При этом у мутанта 885 нарушениеразвития симбиоза наблюдалось на очень ранней стадии – до скручиваниякорневых волосков, что свидетельствует о необходимости LysM-РПК К1 для129инициации симбиоза. Сходный фенотип был выявлен у мутанта гороха погену sym10 (Madsen et al., 2003).Рисунок 34. Анализ мутантов гороха 885 и 817 по гену К1 (Kirienko et al.,2016). A – Nod- фенотип мутанта 885; Б, В – нарушение развития симбиоза на раннейстадии до скручивания корневых волосков; Г – мутант 817, нарушение роста и развитияинфекционных нитей, Д – остановка развития примордиев клубеньков, Е - абортированиеИН, отсутствие выхода бактерий.
IT – инфекционная нить, NP – примордий клубенька.Для анализа растений был использован штамм Rh. leguminosarum CIAM1026, содержащийплазмиду pJP2neo-gusA.У линии 817, вероятно из-за более слабого влияния мутации,наблюдали нарушение развития инфекционных нитей и закладки примордиевклубеньков на ранних стадиях, а также отсутствие выхода бактерий изинфекционных нитей.
Таким образом, на основании анализа мутантов былиполучены доказательства того, что К1 рецептор необходим для контроляразвития симбиоза. Более того, схожее влияние мутации в гене sym10 и k1(линия 885), а также данные об отсутствии функциональной активностикиназного домена у Sym10 позволяют нам предположить, что возможноформирование гетеродимерного комплекса между рецепторами Sym10/K1 наначальных этапах развития симбиоза у гороха.1301.5.1 Анализ способности рецептор-подобных киназ гороха P. sativum L.формировать олигомерные комплексы при ко-экспрессии в листьях N.benthamiana.1.5.1.1 Изучение взаимодействия между рецепторами Sym10 и К1 при коэкспрессии в листьях N.
benthamiana.Основным принципом работы мембранных рецепторов является ихолигомеризация(формированиегомо-илигетерокомплексовмеждумолекулами белка) при связывании лиганда (Wang et al., 2005, 2008; Robatzeket al., 2006; Chen et al., 2010; Petutsching et al., 2010; Schultze et al., 2010; Hanet al., 2014).
Мы предположили, что сходный механизм работы может быть иу рецепторов к Nod-факторам. Как показал анализ литературных данных,наиболее часто используемым методом изучения взаимодействия рецепторовможет быть FRET (Förster resonance energy transfer), который основан наанализе белков, слитых с флюорофорными группами CFP и YFP, междукоторыми может происходить перенос энергии при близком контактебелковых глобул (не более 10 нм).У бобовых растений подобный анализ был использован при изучениивзаимодействия белков-рецепторов NFR5 и NFR1 L.
japonicus, которые былико-экспрессированы в листьях N. benthamiana (Madsen et al., 2010). Однако вэтом случае при ко-экспрессии наблюдали быстрое развитие реакциигиперчувствительности,ведущейкгибеликлеток,вкоторыхсинтезировались оба белка (Madsen et al., 2010). Такого лизиса непроисходило при моно-трансформации клеток конструкцией для синтезаодного белка.
Таким образом, классический FRET анализ для рецепторовданного типа провести было нельзя, но сама реакция гиперчувствительностисвидетельствовала о взаимодействии белков-рецепторов.131Для изучения взаимодействия рецепторов Sym10 и К1, нами былапроведена ко-трансформация листьев N. benthamiana одновременно двумяконструкциями для экспрессии этих белков. При трансформации листьевконструкциямидляэкспрессиикаждогобелкаотдельно(моно-трансформация), наблюдали эффективный синтез как белка Sym10, так ибелка К1 через 48 часов после трансформации (рисунок 35).
О синтезекаждого отдельного белка при этом судили по появлению сильногофлюоресцентного свечения мембран клеток листьев в трансформированнойобласти (рисунок 35). Однако ко-экспрессия двух белков Sym10 и К1приводила к развитию реакции гиперчувствительности (эффекту гибеликлеток) через 48 часов, после того как уровень синтеза этих белков достигалвысокого уровня (рисунок 35). Такого взаимодействия, приводящего кэффекту гибели клеток, мы не наблюдали, когда листья были котрансформированы конструкциями для экспрессии белков Sym10 и Sym19(является рецептором, который также активируется при связывании Nodфакторов с корнями гороха). Sym19 относится к белкам LRR-семейства сактивным киназным доменом, для которых характерна способностьформировать гетеродимеры, однако этот рецептор не был способенвзаимодействовать с Sym10.
Таким образом, на основании развития реакциигиперчувствительности при ко-трансформации листьев N. benthamianaконструкциями для синтеза белков Sym10 и К1, можно сделать вывод о том,что взаимодействие между этими белками является специфичным.Нами было также изучено влияние обработки Nod-факторами листьевN. benthamiana. Было показано, что формирование комплексов междубелками-рецепторами в листьях N.
benthamiana не зависело от присутствиялиганда Nod-фактора (данные не представлены).Таким образом мы полагаем, что LysM-РПК К1 – хороший кандидат нароль «нового» рецептора, так как способен формировать комплекс с Sym10 и,кроме того, в экспериментах по математическому моделированию, для него132показанавозможностьсвязываниялигандаNod-факторасвысокойспецифичностью.Рисунок 35. Анализ развития реакции гиперчувствительности присовместном синтезе LysM-РПК гороха Sym10, K1 и Sym37 в листьях N.benthamiana (Kirienko et al., 2016). Рецепторы были синтезированы в видесоставных белков, содержащих флюорофорные группы YFP и RFP при временнойтрансформации листьев Nicotiana benthamiana с помощью Agrobacterium tumefaciens.Sym10-Rfp и K1-Yfp были локализованы в плазматической мембране при монотрансформации (левая панель).
Развитие реакции гиперчувствительности наблюдали прико-экспрессии Sym10 + K1 и Sym10 + Sym37 (правая панель, A – 2 дня послетрансформации, B – 5 - 6 дней после трансформации). Реакция отсутствовала при коэкспрессии Sym10 + Sym19.1.5.1.2 Изучение взаимодействия рецепторов Sym10 и Sym37 при коэкспрессии в листьях N.
benthamiana.Настакжеинтересоваловозможноевзаимодействиемеждурецепторами Sym10 и Sym37. При трансформации листьев N. benthamianaконструкциями для экспрессии каждого белка отдельно, мы наблюдалиэффективный синтез как Sym10, так и Sym37 (рисунок 35). Ко-экспрессия133двух белков Sym10 и Sym37, также как и в случае с белками Sym10 и К1,приводила к эффекту гибели клеток через 48 часов (рисунок 35).Следовательно, на основании проведенного теста было показано, чтовзаимодействовать между собой могут как белки Sym10/ К1, так и Sym10/Sym37. Сходные результаты были получены и при анализе взаимодействиябелков M.
truncatula NFP и LYK3, которые являются гомологами Sym10 иSym37 гороха (Pietraszewska-Bogiel et al., 2013). Так как у двух бобовыхрастений наблюдается очень сходный процесс формирования клубеньков, апроцент сходства гомологичных рецепторов достаточно высок, то работарецепторов к Nod-факторам у них может быть очень похожа. Ко-экспрессиябелков NFP и LYK3 вызывала эффект гибели трансформированных клеток,сходный с тем, который мы наблюдали при взаимодействии белков Sym10 иK1, а также Sym10 и Sym37.Таким образом, рецепторные белки гороха К1 и Sym37 имеют высокийуровень сходства (между К1 и Sym37 на уровне аминокислот - 85,7%), и коэкспрессия каждого из этих белков с Sym10 вызывает сходный эффект(развитие литической реакции при одновременной экспрессии двух белков влистьях N.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
