Диссертация (1144752), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Кроме того, вбактериальной системе белки часто образуют нерастворимые образования тельца включения (англ. inclusion bodies), что требует подбора определенныхусловий (температуры, концентрации индуктора, штаммов, времени синтеза)для получения этих белков в растворимом виде. Тем не менее, учитываявозможность получения белков-рецепторов Sym10 и Sym37 в большихколичествах при синтезе в бактериях, мы разработали подходы дляэкспрессии генов рецепторов в бактериальной системе и попыталисьполучить эти белки в растворимом виде.
Вместе с тем, для наработки белковснеобходимымивторичнымимодификацияминамибылатакжеосуществлена экспрессия генов рецепторов в гомологичной растительнойсистеме – листьях N. benthamiana.1111.2.1.1. Конструирование векторов, обеспечивающих внутриклеточныйсинтез белков-рецепторов Sym10 и Sym37 в бактериях E. coli.Для наработки белков-рецепторов Sym10 и Sym37 гороха P. sativum вбактериях E. coli были созданы генетические конструкции в векторе pRSETa,для экспрессии клонированных генов под контролем высоко активногопромотора Т7 (промотора гена 10 фага Т7) (рисунок 21) (Долгих и др., 2010).Важной проблемой, которую необходимо было решить, являлось получениерекомбинантного белка-рецептора в растворимой форме, поскольку только вэтом случае можно изучить его связывающую способность с лигандом.Связывание Nod-факторов происходит с внеклеточными доменами белковрецепторов, поэтому нами были получены конструкции, кодирующие тольковнеклеточные домены (EСD – от англ.
extracellular domain) рецепторовSym10 и Sym37 без трансмембранного и киназного доменов, а также безсигнального пептида. Мы предположили, что при экспрессии тольковнеклеточного домена рецептора без гидрофобного трансмембранногоучастка и сигнального пептида, можно получить белок в растворимой форме.Так как в бактериях отсутствуют ферменты для удаления сигнальныхпептидов белков эукариот, праймеры были подобраны таким образом, чтобыв амплифицированные продукты не вошли последовательности, кодирующиесигнальные пептиды белков Sym10 и Sym37 (рисунок 21). Полученныеконструкции были названы pRSETa/Sym10-ECD и pRSETa/Sym37-ECD(рисунок 21), а образующиеся белки – Sym10-ECD и Sym37-ECD (ECD –extracellular domain), соответственно.
В составе Sym10-ECD и Sym37-ECDприсутствовали последовательности из шести остатков гистидина (His6 - tag),позволяющиерекомбинантныхосуществлятьбелковбыструюметодомхроматографии.112иэффективнуюметаллохелатнойочисткуаффиннойРисунок 21. Схема генетических конструкций на основе вектораpRSETa, необходимых для синтеза внеклеточных доменов рецепторныхкиназ Sym10 и Sym37 P. sativum (Долгих и др., 2010). Стрелкой указан сайтгидролиза для энтерокиназы, которая может быть использована для удаления His6 - tag.1.2.1.2. Оптимизация условий наработки рекомбинантных белковрецепторов в штамме E.
coli С41.Синтез белков был осуществлен в штамме E. coli C41 (мутантныйштамм, полученный на основе штамма BL21 (DE3)) (Miroux and Walker,1996). Денатурирующий электрофорез в ПААГ показал наличие в лизатахклеток,трансформированныхрекомбинантнойплазмидой,белковыхпродуктов с молекулярными массами, соответствующими предсказаннымдля Sym10-ECD и Sym37-ECD (27 и 25 кДа, соответственно), синтез которыхнаблюдали в ответ на обработку индуктором ИПТГ (рисунок 22). Анализсодержания белков в различных субклеточных фракциях показал, что притемпературе 28оС рекомбинантные белки Sym10-ECD и Sym37-ECDсинтезируются в растворимой форме (белки присутствуют в растворимойцитозольной фракции после центрифугирования при 100 000 g), а при 37оС –агрегируют в виде телец включения, которые осаждаются при скорости 10000 g (рисунок 22).113Рисунок 22.
Анализ содержания рекомбинантных белков Sym10-ECD иSym37-ECD в различных субклеточных фракциях бактерий E. coli.Снижение температуры культивирования и использование штамма E.coli C41 оказалось эффективным для наработки внеклеточных доменовбелков-рецепторов в растворимой форме. Таким образом, с помощьюполученных генетических конструкций и оптимизации условий синтеза намудалось получить внеклеточные домены белков-рецепторов в растворимойформе, что было необходимо для дальнейших экспериментов.1.2.1.3. Очистка рекомбинантных белков Sym10-ECD и Sym37-ECDметодом металлохелатной аффинной хроматографии.Для выделения и очистки белков Sym10-ECD и Sym37-ECD,синтезированных в культуре клеток E.
coli, использовали жидкостнуюхроматографию низкого давления. После посадки на колонку белокэлюировали ступенчатыми концентрациями имидазола – 100 мМ, 200 мМ и500 мМ (рисунок 23, 24). Белок Sym10-ECD был преимущественноэлюирован с колонки при концентрации имидазола 200 мМ (наличиерекомбинантного белка в различных фракциях, собранных после элюции сколонки, детектировали с анти-His антителами методом Вестерн-блот114гибридизации). Белок Sym37-ECD был выявлен в двух фракциях – послеэлюции 100 мМ имидазолом (фракция 1, основная часть белка) и 200 мМимидазолом (фракция 2, меньшая часть белка).
Аликвоты белков изсобранных после элюции фракций разделяли в ПААГ и гибридизовали спомощью анти-His антител (рисунки 25, 26).Кроме того, чистоту белковых препаратов после элюции имидазоломтакже проверяли при разделении в ПААГ с последующей окраской серебром.Было показано, что только во фракциях, смываемых 200 мМ имидазолом,белки Sym10-ECD и Sym37-ECD не содержат примесей (данные непредставлены).
Таким образом, в результате очистки нами были полученыочищенные до гомогенного состояния белки Sym10 и Sym37, собранныепосле элюции 200 мМ имидазолом (рисунок 23, 25). Выход рекомбинантныхбелков после очистки металлохелатной хроматографией из 300 мл культурыклеток E. coli составлял в среднем 100 – 200 мкг. Очищенные до гомогенногосостояния белки Sym10-ECD и Sym37-ECD были использованы длядальнейшего анализа связывающей способности с лигандом.Рисунок 23. Очистка рекомбинантного белка-рецептора Sym10-ECD спомощью жидкостной хроматографии низкого давления.Внеклеточный домен рецептора Sym10 был наработан в клетках E.
coli C41 в растворимомвиде. Белок экстрагировали из 300 мл бактериальной культуры после индукции ИПТГ (2часа).ПослепосадкинаNi-CAMколонку,115элюциюбелковосуществлялиповышающимися концентрациями имидазола – 100 мМ, 200 мМ и 500 мМ.Максимальный выход белка наблюдали во фракции, полученной после элюции 200 мМимидазолом (пик отмечен стрелкой).Рисунок 24. Анализ очищенных фракций белка был проведен методомВестерн-блот гибридизации с анти-His антителами. НС – несвязавшийсябелок; П1, П2 – фракции 1 и 2, полученные после промывки колонки буфером; С7 - С11 –фракции, полученные после смыва с колонки белка 200 мМ имидазолом (максимумсодержания белка выявлен во фракции С8).
Стрелкой отмечена фракция с максимальнымсодержанием очищенного рекомбинантного белка.Рисунок 25. Очистка рекомбинантного белка-рецептора Sym37-ECD спомощью жидкостной хроматографии низкого давления.Внеклеточный домен рецептора Sym37 был также наработан в клетках E. coli C41 врастворимом виде после индукции ИПТГ (2 часа).
После посадки на Ni-CAM колонкуэлюцию белков осуществляли повышающимися концентрациями имидазола – 100 мМ,200 мМ и 500 мМ. Выход белка наблюдали во фракциях, полученных после элюции 100мМ (максимум во фракции В8) и 200 мМ имидазолом (фракция С8). Объем фракциисоставил 1 мл.116Рисунок 26. Анализ очищенных фракций белка был проведен методомВестерн-блот гибридизации с анти-His антителами. НС – не связавшийсябелок; П1, П2 – фракции 1 и 2, полученная после промывки колонки буфером; B5 - B8 –фракции, полученные после смыва с колонки белков 100 мМ имидазолом.
Стрелкойотмечена фракция В8 с максимальным содержанием белка Sym37 при смыве с колонки100 мМ имидазолом. С8, С9 – фракции, полученные после смыва с колонки белков 200мМ имидазолом. Стрелкой отмечена фракция С8 с максимальным содержанием белкаSym37 при смыве с колонки 200 мМ имидазолом.1.2.1.4. Анализ связывающей способности внеклеточных доменов Sym10ECD и Sym37-ECD, полученных при гетерологичной экспрессии вбактериях, с Nod-факторами.Оценку связывающей способности внеклеточных доменов рецепторовSym10 и Sym37 с Nod-IV, V, C18:4, С18:1, Ac проводили с помощью методаповерхностного плазмонного резонанса на биосенсоре Proteon XPR36,позволяющего работать с лигандом без меток (рисунок 27).
C этой цельюбелки, содержащие His6-метку, были иммобилизованы на чипе HTG, алиганд - Nod-IV, V, C18:4, С18:1, Ac использовали в поступающем растворе.117Рисунок 27. Анализ связывания внеклеточных доменов рецепторовSym10-ECD и Sym37-ECD с Nod-IV, V, C18:4, C18:1, Ac проводили спомощью метода поверхностного плазмонного резонанса.С использованием метода поверхностного плазмонного резонанса быловыявлено, что синтезированные в этой системе белки-рецепторы обладаютнизкой связывающей способностью с Nod-факторами. Значения константаффинности были значительно ниже (Kd для Sym10-ECD и Sym37-ECDсоставили 4,5 х 10-6 ± 0,9 и 1,7 х 10-7 ± 0,5 М, соответственно), чем мыожидали на основании их биологической активности (реакция на Nodфакторы проявляется в диапазоне 10-12 – 10-9 М). Нельзя было исключить,что более низкая величина аффинности могла быть связана с тем, что дляанализа использовали редуцированную форму белка (внеклеточный домен)без вторичных модификаций.
В связи с этим мы также осуществилиэкспрессию полноразмерных белков-рецепторов в гомологичной системе(листьях растения N. benthamiana), которая часто используется для наработкирастительных белков в значительных количествах.118Синтез1.2.2.полноразмерныхбелков-рецептороввлистьяхN.benthamiana и анализ их связывающей способности с Nod-факторами.Для синтеза полноразмерных рецепторов гороха Sym10 и Sym37 влистьях N. benthamiana нами были получены генетические конструкции ввекторах pBIN и pB7WG2D (рисунок 28), представляющие собой слияниякодирующих последовательностей генов Sym10 и Sym37 (безинтронныхкопий)споследовательностямиYFP,илиRFP3xFLAG(короткаяаминокислотная последовательность DYKDDDDK, повторенная трехкратно).В векторах pBIN и pB7WG2D последовательности ДНК, кодирующие белкирецепторы, были клонированы под высокоэффективным промотором белкаоболочкивирусатабачноймозаики35S.Всинтезируемыхбелкахпоследовательности YFP, RFP или 3xFLAG находились на С-концах.Присутствие последовательностей YFP, RFP в синтезируемых белкахпозволило определить их локализацию по флюоресценции при экспрессии влистьях, а присутствие FLAG группировки – выявить синтезируемые белки спомощью анти-FLAG антител.Рисунок 28.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
