Диссертация (1144752), страница 23
Текст из файла (страница 23)
truncatula и L. japonicus. В геноме модельного растения M.truncatula было выявлено 10 генов Lyk, тогда как у L. japonicus 8 таких генов(Arrighi et al., 2006; de Mita et al., 2013). У гороха ранее былиидентифицированы только два Lyk гена (PsSym37 и PsK1), кодирующихLysM-RLK, которые вовлечены в контроль развития ризобиального симбиоза(Zhukov et al., 2008; Kirienko et al., 2016). Для идентификации других геновLyk был проведен анализ всех доступных транскриптомных баз P. sativum L.(Franssen et al., 2011; Kaur et al., 2012; Duarte et al., 2014; Zhukov et al., 2015)с помощью полноразмерных кодирующих последовательностей 10 Lyk M.truncatula и 8 L. japonicus.
В результате были идентифицированыполноразмерные и частичные последовательности еще 7 дополнительныхгенов Lyk гороха.Для поиска кандидатов на роль CERK1-подобного рецептора у горохабыл проведен филогенетический анализ. При этом были использованыкодирующие последовательности 10 Lyk генов M. truncatula, 9 генов P.sativum, 8 L. japonicus и 5 A.
thaliana (рисунок 37). Анализ показал наиболееблизкое филогенетическое родство между AtCERK1 и PsLyk9 (рисунок 37).Кроме того, среди 5 генов Lyk Arabidopsis, самый высокий уровень сходства63% был выявлен между AtCERK1 (At3g21630) и PsLyk9 на уровнекодирующих последовательностей. На основании этого мы предположили,чтогенPsLyk9можеткодироватьхитоолигосахаридам.141CERK1-подобныйрецепторкРисунок 37. Филогенетический анализ Lyk генов бобовых растений.Звездочкой обозначены гены, кодирующие LysM-РПК с последовательностью YAQ вкиназном домене, которая играет критическую роль в симбиотическом взаимодействии.142На следующем этапе исследований с помощью вырожденных праймерови процедуры RACE нами был клонирован полноразмерный ген PsLyk9 гороха(рисунок 38).
Сравнительный анализ показал высокий уровень гомологиипоследовательности PsLyk9 с MtLyk9 M. truncatula и LjLys6 L. japonicus (вчастности, уровень сходства составил 86,5% между выявленным нами геномPsLyk9 и MtLyk9, а также 81,3% между PsLyk9 и LjLys6).Рисунок 38. Сравнение нуклеотидных последовательностей геновPsLyk9, MtLyk9 и LjLys6.2.2. Анализ участия рецепторной-киназы Lyk9 в контроле развитиясимбиоза с грибами арбускулярной микоризы.Мы предположили, что рецептор Lyk9 гороха может участвовать вконтроле реакции растений на хитоолигосахариды (n = 4 - 5), которыенеобходимы для развития симбиоза с грибами арбускулярной микоризы(АМ). Для проверки данной гипотезы была проведена работа по поиску ианализу экспрессии генов-маркеров, которые активируются в ответ на143обработку растения короткими олигомерами хитина (n = 4 - 5).
С этой цельюбыл проведен анализ литературных данных по изучению транскриптомовмикоризованных корней бобовых растений. Это позволило выбрать наборгенов (15 представителей), экспрессия которых существенно возрастает приразвитии AM (таблица 1). На основании литературных данных нами быливыбраны гены, уже известные как маркеры развития микоризы у гороха –AM1, AM3, AM5, MAPK, PT4, TI и DRP (Roussel et al., 2001; Grunwald et al.,2004) и M.
truncatula - GST, RAM1, RAM2, NSP1, NSP2, DWARF27, DELLA иTF (Wulf et al., 2003; Liu et al., 2011; Hogekamp et al., 2011; Ortu et al., 2012;Delaux et al., 2013) (таблица 1).Таблица 1. Набор генов, экспрессия которых может служить маркерамиразвития симбиоза с грибами арбускулярной микоризы у растенийгороха.На следующем этапе исследований были выявлены гомологи всех 15генов у гороха и оценена их экспрессия при микоризации корней FinaleRhizophagus irregularis на 7, 14 и 28 сутки после заражения (рисунок 39).Полученные результаты показали, что экспрессия большинства маркеровначинает увеличиваться на14 день после заражения,144а затем достигаетРисунок 39.
Анализ экспрессии генов-маркеров в корнях микоризованных растений Finale на 7, 14 (а) и 28 (б)сутки после заражения (Leppyanen et al., 2016). Уровень экспрессии генов был нормализован относительно экспрессии убиквитина.Результаты представлены в виде отношения уровней экспрессии изучаемого гена в варианте с заражением к контрольному без заражения.145максимума к 28 дню после заражения. Увеличение уровня экспрессии в ответна микоризацию было показано для всех 15 генов, что свидетельствовало отом, что выбранные гены могут являться маркерами развития микоризы угороха. Кроме того, в процессе микоризации увеличивалась и самаэкспрессия гена PsLyk9 (рисунок 39).Однако в проведенном нами эксперименте при внесении инокулюмагрибов АМ мы оценивали увеличение экспрессии маркерных генов в ответна выделение двух типов сигналов – хитоолигосахаридов и Myc-факторов.Основное наше предположение было связано с тем, что Lyk9 контролируетреакцию растений на выделение хитоолигосахаридов (n = 4 - 5).
В связи сэтим, в дальнейших экспериментах мы проанализировали уровни экспрессиигенов-маркеров развитияподавлениемэкспрессииАМ симбиоза в трансгенных корнях гороха сгенаPsLyk9вответнаобработкухитоолигосахаридами (n = 4 - 5).Нам удалось показать, что при подавлении экспрессии гена PsLyk9 (внаших экспериментах на 80%) происходит достоверное снижение экспрессии7 генов из 15 - DRP, RAM1, DELLA, DWARF27, NSP2, PT4 и TI (рисунок 40).Таким образом, рецептор Lyk9 участвует в контроле развития микоризации угороха и ответе растений на обработку хитоолигосахаридами (n = 4-5), чтоделает его наиболее вероятным кандидатом на роль CERK1-подобногорецептора.146Рисунок 40. Анализ экспрессии генов-маркеров развития микоризногосимбиоза в корнях трансгенных растений с подавленной экспрессиейгена PsLyk9 в ответ на обработку ХОС (n = 5) (Leppyanen et al., 2016).Результаты представлены в виде отношения уровня экспрессии изучаемого гена ввариантесРНК-интерференциейкпоказаниюегоэкспрессииврастениях,трансформированных конструкцией для синтеза белка β-глюкуронидазы (GUS-OE,контроль); PsLyk9-RNAi – растения, трансформированные конструкцией для подавленияэкспрессии гена PsLyk9.
Представлены средние значения (n = 5 – 6 трансгенных корней) ±ошибка среднего.2.3.Анализвлияниярецепторной-киназыLyk9наразвитиеустойчивости гороха к фитопатогенным грибам.Для анализа влияния рецептора Lyk9 на иммунитет растений гороханами были получены растения с подавленной экспрессией гена PsLyk9 спомощью РНК-интерференции.
При заражении слабопатогенным штаммомF. culmorum 891 у растений с подавленной экспрессией гена (PsLyk9-RNAi)былисильнееконтрольнымивыраженырастениямипризнакизаболевания(трансформированнымипосравнениюконструкциейсдлясинтеза белка β-глюкуронидазы (GUS)) (рисунок 41).Рисунок 41. Оценка уровня заболеваемости трансгенных растенийгорохас подавленной экспрессией гена147PsLyk9 при заражениислабопатогенным штаммом F. culmorum 891 (Leppyanen et al., 2016). GUSOE – растения, трансформированные конструкцией для синтеза белка β-глюкуронидазыGUS (контроль); PsLyk9-RNAi – растения, трансформированные конструкцией дляподавления экспрессии гена PsLyk9.
Представлены средние значения (n = 10 – 15трансгенных корней) ± ошибка среднего.Обработка трансгенных растений гороха с подавленной экспрессиейгена PsLyk9 хитоолигосахаридами со степенью полимеризации (n = 8) (этисоединения являются эффективными элиситорами защитных реакций угороха), показала, что у таких растений снижаются уровни экспрессии геновPsPAL2, а также PsPR1 и PsPR10 (рисунок 42). Таким образом, полученныеданные свидетельствуют о том, что рецепторная киназа Lyk9 участвует вреакции растений гороха на обработкухитоолигосахаридами (n = 8) иактивации защитных реакций. Это предполагает функциональное сходстворецепторной киназы Lyk9 гороха с CERK1 рецептором риса и Arabidopsis.Рисунок 42.
Анализ экспрессии генов PsPAL1, PsPAL2, PsPR1, PsPR10,кодирующих защитные ферменты и белки, у трансгенных растенийгороха с подавленной экспрессией гена PsLyk9 в ответ на обработкуХОС (n = 8) (Leppyanen et al., 2016). GUS-OE – растения, трансформированныеконструкцией для синтеза белка β-глюкуронидазы GUS (контроль); PsLyk9-RNAi –растения, трансформированные конструкцией для подавления экспрессии гена PsLyk9.Представлены средние значения (n = 5 – 6 трансгенных корней) ± ошибка среднего.1482.4. Получение хитоолигосахаридов с разной степенью полимеризации спомощью биологического синтеза.(Результаты исследований, представленные в разделе 2.4, были полученысовместносВикторовной,аспиранткойФГБНУруководствоВНИИСХМкандидатскойЛеппяненИринойдиссертациейкоторойосуществлено автором настоящего диссертационного исследования).В рамках нашей работы была также решена задача биосинтетическогополучения олигомеров хитина с разной степенью полимеризации, чтоявляется основой для практического использования этих сигнальныхмолекул.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
