Диссертация (1144752), страница 27
Текст из файла (страница 27)
Ген LONELYGUY (LOG) кодирует рибозо-5-монофосфат фосфорибогидролазу, котораянепосредственно вовлечена в активацию цитокининов, то есть катализируетпереход этого гормона из неактивного состояния в составе рибозида вактивное. В результате проведенного анализа доступных баз данныхтранскриптомов гороха, были выявлены шесть предполагаемых генов LOGгороха. Для выявления полноразмерных последовательностей этих геновбыла использована процедура RACE, которая позволила аннотировать всепоследовательности в базе данных NCBI (PsLOG1 – PsLOG6). На следующемэтапе нами были проанализированы изменения в экспрессии генов LOG впроцессе развития симбиоза у гороха (рисунок 53).
На ранних сроках послеинокуляции (1 – 3 дпи) нами было выявлено увеличение экспрессии генаPsLOG5. Кроме того, были выявлены значительные изменения в уровнеэкспрессии генов PsLOG1, PsLOG2, PsLOG4 и PsLOG5, начиная с 7 дпи,когда закладываются клубеньки у гороха.
Максимальных значений уровеньэкспрессии генов LOG достигал на 11 - 14 дпи (в 25 – 30 раз для PsLOG1 и в3 – 5 раз для PsLOG2, в 5 – 8 раз для PsLOG4 и PsLOG5).170Рисунок 52. Экспрессия генов IPT1-6 в корнях гороха Frisson в ответ на инокуляцию Rh. leguminosarum bv. viciaeCIAM 1026. NI – non-inoculated (без инокуляции, dpi – days post inoculation (дни после инокуляции)).171Рисунок 53.
Анализ экспрессии генов PsLOG1, PsLOG2, PsLOG4, PsLOG5 и PsLOG6 в корнях гороха линииFrisson при инокуляции Rh. leguminosarum bv. viciae CIAM1026 на разных сроках после инокуляции.NI – non-inoculated (без инокуляции, dpi – days post inoculation (дни после инокуляции)).172Таким образом, на основании проведенного анализа основных генов,контролирующих метаболизм цитокининов и вовлеченных в первичныйответ растений на действие этих гормонов, можно сделать вывод о том, чтоцитокинины оказывают существенное влияние, как на сам процессинициации симбиоза, так и на закладку и развитие клубеньков у гороха.
Обэтом свидетельствует последовательная активация генов цитокининовогоответа (RR А-типа) у гороха в ответ на инокуляцию ризобиями. Наиболееранний ответ растений на цитокинины наблюдается на 1 – 3 день послеинокуляции (дпи), а затем на 7 – 11 дпи (период, когда происходитформирование примордиев и развитие клубеньков у гороха). Цитокининытакже играют важную роль и в функционирующих клубеньках, поскольку вних достигает очень высокого уровня экспрессия гена PsRR11. При этом воснове изменений в содержании цитокининов, может лежать увеличениеуровняэкспрессиигенов,контролирующихбиосинтез/активациюцитокининов. Ранний этап может быть связан у гороха с индукцией PsIPT1,PsIPT2 и PsLOG5 (при этом об активации рецептора к цитокининам можетсвидетельствовать увеличение экспрессии PsRR5 и PsRR9, PsRR11), апоследующие этапы – с активацией PsIPT1, PsIPT3 и PsIPT4, а такжеPsLOG1, 2, 4 и 5 (при этом маркерами ответа растений на цитокининыявляются PsRR4, PsRR8 и PsRR11).3.2.3.
Анализ содержания различных форм цитокининов в корнях горохапри инокуляции Rh. leguminosarum bv. viciae CIAM1026.Нас интересовало, приводит ли повышение экспрессии генов IPT иLOG к увеличению содержания различных форм цитокининов в корняхгороха. С этой целью были разработаны подходы для выделения и анализаразличных форм цитокининов из корней гороха.
Для выделения цитокининовза основу был взят метод Dobrev и Kaminek (Dobrev and Kaminek, 2002),173использовавших колонки Oasis MCX (Waters). Анализ цитокининовпроводили c помощью ультрапроизводительной жидкостной хроматографиис последующим масс-спектрометрическим анализом.Результаты анализа содержания разных форм цитокининов в корняхгороха при инокуляции и контрольных неинокулированных корняхпредставлены на рисунке 54.
Мы показали, что наиболее значительно вкорнях гороха увеличивалось содержание транс-зеатина в ответ наинокуляцию на 3 дпи, затем к 7 - 10 дпи содержание фитогормона трансзеатина возрастало вновь. На 3 дпи в корнях гороха также увеличивалосьсодержание изопентениладенина. Содержание других форм цитокининов(бензиладенина, дигидрозеатина и их рибозилированных форм) маломенялось в процессе развития клубеньков у гороха. Таким образом, намибыло выявлено двухэтапное увеличение содержания цитокинина трансзеатина в корнях гороха при инокуляции, которое соответствовалоизменению экспрессии генов IPT и LOG, контролирующих метаболизмцитокининов.Рисунок 54. Содержание различных форм цитокининов - транс-зеатина(TZ),изопентениладенина(IPA)174ибензиладенина(BA)-внеинокулированных корнях гороха линии Frisson, а также послеинокуляции на 3, 7 и 10 дпи.3.3.
Идентификация генов гороха, контролирующих биосинтез (TAR) итранспорт ауксинов (PIN).Проверка наличия последовательностей в базе данных NCBI (Genebank)показала, что у гороха в настоящее время выявлены несколько геновTRYPTOPHAN AMINOTRANSFERASE RELATED (TAR1,TAR2, TAR3),кодирующих ферменты, подобные триптофан-аминотрансферазам. Нами былпроведен анализ экспрессии трех этих генов у гороха в процессе развитиясимбиоза. Было показано, что в корнях и клубеньках гороха экспрессируютсятолько гены TAR2 и TAR3, тогда как экспрессию гена TAR1 нам выявить неудалось. При этом существенного увеличения уровня экспрессии генов TAR2и TAR3 у гороха в корнях в ответ на инокуляцию выявлено не было (данныене представлены).Кроме того, с помощью анализа всех доступных транскриптомов горохабыли выявлены полные или частичные последовательности 11 генов PsPIN1 PsPIN11.
Название генов PIN гороха были даны в соответствии с известнымигенами PIN1 – 11 модельного растения M. truncatula по наиболее высокомууровню гомологии последовательностей. Далее нами была использованапроцедура RACE (rapid amplification of cDNA ends) для выявленияполноразмерных последовательностей этих генов. В результате былиидентифицированы 11 полноразмерных генов PIN1 – 11 у гороха. Наследующем этапе работы был проведен анализ изменений в экспрессии геновPIN при развитии клубеньков у гороха (рисунок 55 б). Было установлено, чтов ответ на инокуляцию ризобиями на ранних стадиях развития симбиоза (1 –3 дпи) увеличивается уровень экспрессии генов PIN2 и PIN4, а уровеньэкспрессии гена PIN3, напротив, существенно подавляется (рисунок 55175б).Рисунок 55.
Анализ экспрессии генов, контролирующих транспортауксинов PsPIN2, PsPIN3, PsPIN4. NI – non-inoculated (без инокуляции, dpi– days post inoculation (дни после инокуляции)).Экспрессия других проанализированных генов PIN мало менялась впроцессе развития симбиоза (данные не представлены). Таким образом, наранних стадиях развития симбиоза (1 – 3 дпи) увеличение содержанияцитокининов сопровождается изменением уровня экспрессии генов PIN,контролирующих транспорт ауксина.С какими процессами может быть связано увеличение содержанияцитокининов в корнях гороха на ранних стадиях после инокуляции? Анализлитературных данных показывает, что цитокинины могут оказывать влияниена распределение и синтез ауксинов у бобовых растений при формированииклубеньков (Plet et al., 2011; Suzaki et al., 2012).
Получены данные о том, чтоу мутанта M. truncatula cre1 по рецептору к цитокининам в отличие отрастений дикого типа не нарушается полярный транспорт ауксинов в корняхпри инокуляции (Plet et al., 2011). У мутантa L. japonicus snf2 со спонтанноактивированным рецептором к цитокининам наблюдали положительноевлияние цитокининов на накопление ауксинов, что было связано сувеличением экспрессии гена биосинтеза этих гормонов TAR1 (Suzaki et al.,2012, 2013).176Выявленное нами подавление экспрессии PIN3, а также увеличениеуровня экспрессии генов PIN2 и PIN4, контролирующих транспорт ауксинову гороха, соответствует представлению о том, что у бобовых растений,формирующихклубенькинедетерминированноготипа,вответнаинокуляцию или обработку Nod-факторами временно нарушается полярныйтранспорт ауксинов (ПАТ), и ауксины накапливаются локально в клеткахвнутренней коры (Mathesius et al., 1998; De Billy et al., 2001; Wasson et al.,2006; Huo et al., 2006).
Мы полагаем, что PIN3 гороха контролируетбазипетальный транспорт и подавление экспрессии этого гена связано сингибированием ПАТ, тогда как PIN2 и PIN4 у гороха могут контролироватьлатеральный транспорт ауксинов, что определяет локальное накоплениеауксинов в клетках коры.1773.4. Анализ взаимодействия между компонентами сигнального каскада,активируемого Nod-факторами, и регуляторами фитогормональногоответа.3.4.1 Изучение влияния экзогенного цитокинина БАП на регуляторыцитокининового ответаи основные транскрипционные факторысигнального каскада, активируемого Nod-факторами, у гороха.Другой целью нашей работы было выяснение возможных механизмоввзаимодействия компонентов сигнального каскада, активируемого Nodфакторами, с цитокининами и ауксинами.
Мы предположили, что приобработке растений экзогенным цитокинином БАП могут быть выявленыэтапы передачи сигнала от Nod-факторов, на которые могут оказыватьвлияние эндогенные цитокинины в процессе развития симбиоза. Для этогонами был проведен анализ влияния обработки растений экзогеннымцитокинином БАП (в течение 2 и 5 часов) на изменение экспрессии геноврегуляторовцитокининовогоответа(RRА-типа),атакжерядатранскрипционных регуляторов, активируемых Nod-факторами.У растений гороха в ответ на обработку БАП в концентрации 10 -7 Мбыло выявлено значительное увеличение экспрессии генов регуляторовцитокининового ответа - PsRR4, PsRR8 (RR А-типа) по сравнению снеобработанными корнями, что свидетельствовало о реакции растений наобработку цитокинином при данной концентрации (рисунок 56 а, б).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
