Диссертация (1144752), страница 28
Текст из файла (страница 28)
Крометого, в ответ на обработку экзогенным цитокинином у проростков горохазначительноувеличивалсяуровеньэкспрессиигена,кодирующеготранскрипционный фактор NIN (PsSym7) (через 2 и 5 часов после обработки увеличение в 30 – 40 раз) по сравнению с контрольными растениями, необработанными БАП (рисунок 56). Экспрессия гена, кодирующего другой178транскрипционный фактор NSP2 (PsSym7), увеличивалась кратковременно –через 2 часа после обработки БАП (рисунок 56), а к 5 часам снижалась доуровня контроля (рисунок 56).звездочкой отмечены значения, достоверно отличающиеся от контроляРисунок 56.
Влияние экзогенно добавленного цитокинина БАП (10-7 М)на экспрессию генов цитокининового ответа – PsRR1, PsRR4 и PsRR8, атакже генов, кодирующих транскрипционные факторы NIN (PsSym35) иNSP2 (PsSym7) активируемого Nod-факторами сигнального пути угороха линии SGE через 2 часа (а) и 5 часов (б) после обработки.179Относительно недавно в промоторной области гена NSP2 M. truncatulaбыла выявлена последовательность RRBS (RR binding site), c которойсвязывается транскрипционный фактор RR1 В-типа у M. truncatula, чтосвидетельствуетотом,чтоэкспрессияэтогогенадействительнорегулируется цитокинином (Ariel et al., 2012).
Таким образом, у горохаактивациярецептораприсвязываниицитокининовоказываетнепосредственное влияние на активацию транскрипционных факторов NIN(PsSym35) и NSP2 (PsSym7), что демонстрирует возможность взаимодействиямежду двумя сигнальными путями, активируемыми Nod-факторами ицитокининами.3.4.2 Сравнительный анализ экспрессии генов, контролирующихбиосинтез/ активацию цитокининов и цитокининовый ответ у мутантовгороха.Мы показали, что изменения в содержании цитокининов и активациярецептора к цитокининам могут происходить на нескольких этапах развитиясимбиоза у гороха.
На ранних стадиях развития симбиоза увеличениесодержанияцитокининовпроисходитодновременносизменениемэкспрессии генов PIN, контролирующих транспорт ауксинов. Это можетбыть связано с взаимным влиянием гормонов цитокининов и ауксинов.Неслучайно анализ мутанта люцерны слабоусеченной cre1 с нарушениемрецепции цитокининов показал, что у него отсутствует ингибирование ПАТи перераспределение белков PIN в ответ на инокуляцию (Plet et al., 2011).Следовательно, на ранних этапах развития симбиоза цитокинины могутоказывать влияние на экспрессию генов PIN, контролирующих транспортауксинов.Сходное влияние цитокининов на экспрессию и распределение белковPIN наблюдается при формировании других латеральных органов у растений180– боковых корней (Dello Ioio et al., 2008; Laplaze et al., 2007).
Известно, чтопри добавлении экзогенного цитокинина БАП или усилении экспрессиигенов IPT происходит видоизменение примордия бокового корня – онуплощается (Laplaze et al., 2007). При этом цитокинины влияют наэкспрессию генов PIN, что приводит к локальному изменению распределенияауксинов (Laplaze et al., 2007). Следовательно, на начальных этапахпоявления клубеньков у бобовых растений, формирующих клубенькинедетерминированного типа, могут работать механизмы, которые вовлеченыв контроль органогенеза боковых корней.Для выяснения вопроса о том, к каким изменениям может приводитьувеличение содержания цитокининов в процессе развития клубеньков, тоесть на более поздних стадиях, были использованы растения исходной линииSGE и полученные на их основе Nod- симбиотические мутанты по генам sym7(SGENod- -6), sym35 (SGENod- -1), а также неэффективные по симбиозу Fixмутанты по генам sym33 (SGEFix- -2, SGEFix- -5) и sym40 (SGEFix- -1).В процессе развития клубеньков у растений исходной линии SGEвозрастала экспрессия генов PsIPT1, PsIPT3, PsIPT4 и PsLOG1, 2, 4, 5, атакже маркеров цитокининового ответа PsRR4, PsRR8 и PsRR11, начиная с 7дпи.
Анализ показал, что у Nod- мутантов гороха по генам sym7 и sym35 вответ на инокуляцию (7 дпи) экспрессия генов, контролирующих биосинтезцитокининов (PsIPT1, PsIPT3, PsIPT4 и PsLOG1, 2, 4, 5) и ответ растений нацитокинины (PsRR4, PsRR8 и PsRR11), не увеличивалась (рисунок 57).Напротив, у формирующих клубеньки Fix- мутантов гороха по гену sym33(SGEFix--5, SGEFix--2) на 7 дпи были повышены уровни экспрессии двухгенов PsIPT1, PsIPT4, а также экспрессия генов PsRR4 и PsRR8, являющихсямаркерами активации рецептора к цитокининам (рисунок 57).
Более того, на14 дпи в клубеньках мутантов по гену sym33 уровни экспрессии PsIPT1,PsIPT4, а также PsRR8 были выше по сравнению со стадией 7 дпи, чтоподтвердило их активацию (рисунок 57). Следовательно, активация генов181PsIPT1, PsIPT4 показывает необходимость синтеза цитокининов дляформирования клубеньков, поскольку у мутантов по генам sym7 и sym35, укоторых органогенез клубеньков нарушен, эти гены не активируются.Рисунок 57. Анализ экспрессии генов IPT1, IPT3, IPT4 и RR8 у растенийгороха дикого типа SGE и мутантов SGENod--6 (sym7), SGEFix--5 (sym33)и SGENod--1 (sym35) в ответ на инокуляцию Rh.
leguminosarum CIAM1026 на 7 дпи.Напротив, в клубеньках мутанта по гену sym33 SGEFix--2 и SGEFix--5(14 дпи) не увеличивалась экспрессия генов PsIPT3, PsLOG1, 2, 4, 5, а такжеPsRR11 (рисунок 57, 58). Клубеньки мутантов по гену sym33 остаютсянеинфицированными, поскольку содержат «запертые» инфекционные нити,из которых не наблюдается выход бактерий в цитоплазму растительнойклетки (Voroshilova et al., 2009). Таким образом, с выходом бактерий изинфекционных нитей в клетки коры корня и развитием инфекционногопроцесса может быть связана дополнительная активация рецептора кцитокининам. Вероятно, дополнительная активация рецептора может бытьсвязана с новым синтезом цитокининов с помощью IPT3 и LOG1, 2, 4, 5ферментов (рисунок 58).182Для проверки данного предположения нами был дополнительнопроведен анализ мутанта гороха по гену sym40 SGEFix--1, у которогонарушены процессы инфицирования клубеньков и дифференцировки.
Умутанта sym40 формируются гипертрофированные инфекционные нити,однако выход бактерий из инфекционных нитей происходит, хотя и сзадержкой по времени (Voroshilova et al., 2009). В отличие от мутантов погену sym33 SGEFix--2 и SGEFix--5, в клубеньках мутанта по гену sym40SGEFix--1 нами было выявлено увеличение экспрессии IPT3 и LOG1, 2, 4 и 5,а также PsRR11 (рисунок 58).Рисунок 58.
Анализ экспрессии генов PsIPT1, PsIPT4, PsLOG1, PsRR8 иPsRR11 у растений гороха дикого типа SGE имутантов SGEFix--5(sym33) и SGEFix--1 (sym40) в ответ на инокуляцию Rh. leguminosarumCIAM 1026 (14 дпи).Таким образом, анализ мутантов гороха показал, что отсутствиеспособности формировать клубеньки у Nod- мутантов гороха sym7 и sym35183соответствовало тому, что у них не индуцируются гены биосинтеза/активации цитокининов (PsIPT1, PsIPT3, PsIPT4, LOG1, 2, 4 и 5) и маркерыактивации рецептора к цитокининам PsRR4, PsRR8 и PsRR11. Напротив, умутанта sym33 клубеньки формируются и есть увеличение экспрессии геновPsIPT1 и PsIPT4, что непосредственно связано с формированием клубеньков.Это подтверждает важность именно биосинтеза цитокининов в растениях дляактивации рецептора к этим гормонам при распространении сигнала от Nodфактора.
Однако, отсутствие активации PsIPT3 и PsLOG1, 2, 4, 5 генов, атакже PsRR11 у этого мутанта демонстрирует, что с выходом бактерий изинфекционных нитей может быть связана дополнительная активациярецептора к цитокининам у гороха. Такая активация генов PsIPT3 и PsLOG1,2, 4, 5 генов, а также PsRR11 наблюдалась у мутанта по гену sym40, укоторого происходит инфекция клубеньков, но нарушены дальнейшие этапыдифференцировки тканей клубенька.3.4.3 Локализация ответа на ауксины и цитокинины у мутантов SGEFix -2, SGEFix- -5 (sym33) с помощью репортерных конструкций DR5::GFP иpRR4::GUS.В связи с выявленными нами отличиями в экспрессии генов биосинтезацитокининов у мутантов по гену sym33 (SGEFix--2 и SGEFix--5), необходимобыло дополнительно провести у них анализ распределения фитогормоновцитокининов и ауксинов.
У трансгенных растений SGEFix --5 и SGEFix--2,содержащих генетические конструкции DR5::GFP и pRR4::GUS, нами быливыявленысущественныеизменениявраспределенииауксиновицитокининов по сравнению с растениями исходной линии SGE на 14 дпи.Значительно более сильный ответ на ауксины был выявлен в клубенькахмутантов SGEFix--5 и SGEFix--2 (sym33) (рисунок 59 а). При этом ответ былравномерно распределен по всему клубеньку в отличие от растений исходной184линии SGE, у которой ответ на ауксины был связан только с перифериейклубенька. Вероятно, высокий уровень ауксинов у мутанта приводил к тому,что процессы дифференцировки тканей клубеньков у него нарушались.Сходным образом у растений L.
japonicus, формирующих клубенькидетерминированного типа, мутант по гену cyclops характеризовался высокимсодержанием ауксинов (Suzaki et al., 2012). Это указывает на то, что впроцессе передачи сигнала от Nod-фактора транскрипционный факторCYCLOPS/IPD3 влияет на изменение в распределении фитогормонов вклубеньке.Напротив, зона локализации ответа на цитокинины была значительноредуцирована у мутанта SGEFix--2 (sym33) по сравнению с растениямиисходной линии SGE (рисунок 59 а). В отличие от мутанта SGEFix --5, вотдельных клубеньках мутанта SGEFix--2 может наблюдаться выходбактерий из инфекционных нитей в цитоплазму клеток клубенька. У мутантапо гену sym33 SGEFix--2 окрашивание GUS наблюдали только в меристеме,проводящих тканях (проводящих пучках) и слабое окрашивание – в тех зонахклубенька, где наблюдался выход бактерий из инфекционных нитей умутанта (рисунок 59 б).Рисунок 59.
Локализация ответа на ауксины и цитокинины вклубеньках мутанта SGEFix−-2, содержащих ауксин- и цитокинин185регулируемые конструкции DR5::GFP-NSL (А) и pRR4::GUS (Б). Ответ нацитокинины (отмечен стрелками) был связан с проводящими пучками, меристемойи центральной зоной клубенька, где происходит выход бактерий.Таким образом, изменения в биосинтезе и накоплении цитокининов иауксинов у мутантов гороха SGEFix--2 и SGEFix--5 могут приводить кнарушениям в развитии симбиоза. У мутантов по гену sym33 из-за нарушенияинфекционного процесса и выхода бактерий из инфекционных нитей,нарушаются процессы дифференцировки тканей клубеньков.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
