Диссертация (1144752), страница 26
Текст из файла (страница 26)
truncatula выявлено семейство геновRR А-типа, в состав которого входит 13 представителей, 7 из которыхэкспрессируются в корнях MtRR4, MtRR5, MtRR (Medtr3g078613), MtRR8,MtRR9, MtRR11 и MtRR15 (Op den Camp et al., 2012). Анализ данныхтранскриптомного анализа по экспрессии этих генов в ответ на обработкуNod-факторами и инокуляцию (van Zeijl et al., 2015; база данных MedicagoGene Expression Atlas (http://mtgea.noble.org/v3/) показал, что шесть геновэтого семейства MtRR4, MtRR5, MtRR (Medtr3g078613), MtRR8, MtRR9 иMtRR11 быстро активируются в ответ на обработку Nod-факторами (через 3часа), тогда как экспрессия MtRR15 не изменяется. В связи с этим мыориентировались на выявление у гороха гомологов именно этих шести генов.В результате выполненных нами исследований были клонированышесть полноразмерных генов гороха PsRR4 (657 п.о., полноразмерная CDS(от англ.
coding sequence), PsRR5 (657 п.о.), PsRR6 и PsRR8 (638 п.о.), а такжеPsRR9 (495 п.о.) и PsRR11 (441 п.о.), которые показали высокую степеньгомологииc(Medtr3g078613),соответствующимигенамиMtRR4,MtRR5,MtRRMtRR8, MtRR9 и MtRR11 M. truncatula (рисунок 48, 49).Таким образом, нами были выявлены у гороха шесть гомологов генов RR Атипа M. truncatula.162В дополнение к этому, нами были клонированы гены PsRR1, PsRR2 иPsRR3 гороха, кодирующие регуляторы цитокининового ответа RR B-типа –транскрипционные факторы, которые непосредственно активируются присвязывании цитокининов с рецептором и регулируют экспрессию цитокининрегулируемых генов.
Сравнительный анализ показал, что гены PsRR1, PsRR2и PsRR3 гороха являются наиболее близкими гомологами генов MtRR1,MtRR2 и MtRR3 M. truncatula (данные не представлены).Рисунок 48. Сравнение нуклеотидных последовательностей генов PsRR4А-типа и MtRR4 А-типа (сходство 79,3% по CDS) (а), PsRR5 А-типа и163MtRR5 А-типа (сходство 84,7% по CDS) (б), PsRR8 А-типа и MtRR8 Атипа (сходство 87,9% по CDS) (в).Рисунок 49.
Сравнение нуклеотидных последовательностей генов PsRR6и Medtr3g078613 (сходство 70,8%), PsRR9 и MtRR9 (сходство 88%), атакже PsRR11 и MtRR11 (сходство 71,5%).164Анализ динамики экспрессии шести генов PsRR4, PsRR5, PsRR6,PsRR8, PsRR9 и PsRR11 (регуляторов цитокининового ответа RR А-типа)выявил активацию пяти из них в процессе развития симбиоза у гороха. Мыпоказали, что три регулятора цитокининового ответа PsRR5, PsRR9 и PsRR11активировались у гороха при инициации симбиоза на 1 - 3 дпи (рисунок 49).Повторноеувеличениеэкспрессиигеновцитокининовогоответапроисходило в процессе развития клубеньков, начиная с 5 - 7 дпи. При этомуровеньэкспрессиигенаPsRR4увеличивалсяпосравнениюснеинокулированными корнями (в среднем в 1,5 – 3 раза), тогда как наиболеесущественно в процессе развития клубеньков изменялась экспрессия геновPsRR8 (в 3 -5 раз) и PsRR11 (в 80 – 100 раз) (рисунок 50).
Экспрессия геновPsRR4 и PsRR8 последовательно возрастала в ходе развития симбиоза,начиная с 5 – 7 дпи и достигая максимума на 11 – 14 дпи. Экспрессия генаPsRR11 начинала повторно увеличиваться на 7 - 9 дпи и оставалась оченьвысокой в сформированных клубеньках. Следовательно, экспрессию геновPsRR9, PsRR11, а также PsRR8 и PsRR11 (уровень экспрессии которыхвозрастает наиболеесущественно в ответ на инокуляцию) удобноиспользовать у гороха в качестве маркеров активации рецептора кцитокининам при его связывании с этими фитогормонами на разных стадияхразвития симбиоза.165Рисунок 50.
Анализ экспрессии генов цитокининового ответа PsRR4, PsRR5, PsRR8, PsRR9 и PsRR11 А-типа вкорнях гороха линии Frisson на различных сроках после инокуляции методом ОТ-ПЦР в реальном времени.NI – non-inoculated (без инокуляции, dpi – days post inoculation (дни после инокуляции)).1663.2.2. Выявление генов IPT и LOG, контролирующих биосинтезцитокининов и их переход в активное состояние у гороха.Для ответа на вопрос о том, что лежит в основе изменений в содержаниицитокининов, нами был осуществлен поиск генов биосинтеза цитокининов(IPT), а также генов, контролирующих переход цитокининов из неактивнойформывактивную(LOG).Этигеныурастенийпредставленымультигенными семействами, поэтому нам необходимо было выявить геныIPT и LOG, экспрессия которых возрастает при развитии симбиоза.Основнымгеном,контролирующимпервыйэтапбиосинтезацитокининов, является IPT, кодирующий изопентениладенин трансферазу.
Угороха ранее было выявлено два гена IPT, получивших название IPT1 и IPT2(Tanaka et al., 2006). На основании скрининга всех доступных баз данныхтранскриптомов гороха с использованием последовательностей IPT кДНК M.truncatulaиL.japonicusнамибыливыявлены6частичныхпоследовательностей предполагаемых IPT генов. Для идентификацииполноразмерных последовательностей выявленных генов, была использованапроцедура RACE.
Было показано, что два выявленных гена PsIPT1 и PsIPT2соответствовали ранее охарактеризованным генам гороха (Tanaka et al.,2006). Другие гены были определены нами как PsIPT3, PsIPT4, PsIPT5 иPsIPT6(KP296693,KP296694,KP296695,KP296696).Нуклеотидныепоследовательности вновь выявленных генов показали высокий уровеньгомологии с IPT генами M. truncatula и L. japonicus (рисунок 51).Филогенетический анализ IPT генов P. sativum, M. truncatula и L.japonicus позволил разделить выявленные гены на 6 основных групп(рисунок 51).
PsIPT1 находился в одной группе с MtIPT2 (Medtr4g117330) иLjIPT2 (группа 1). PsIPT2 имел наиболее высокий уровень гомологии сMtIPT4 (Medtr2g022140) и LjIPT4 (группа 2). PsIPT3 был помещен в ту жесамую группу, что MtIPT3 (Medtr1g072540) и LjIPT3. PsIPT4 находился в167одной группе с MtIPT1 (Medtr1g110590) и LjIPT1 (группа 4). PsIPT5 былобъединен в одну группу с MtIPT5 (Medtr4g055110) и LjIPT5 (группа 5).PsIPT6 имел наиболее высокий уровень гомологии с MtIPT6 (Medtr2g078120)и LjIPT6 (группа 6).Рисунок 51. Филогенетический анализ последовательностей генов IPT P.sativum, M. truncatula и L. japonicus.Мы проанализировали, как изменяется экспрессия шести выявленныхгенов PsIPT в корнях гороха при инокуляции с помощью количественнойПЦР, совмещенной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).
Было установлено,что уровень экспрессии генов PsIPT1 и PsIPT2 увеличивался в корнях на168самых ранних сроках после инокуляции (1 - 3 дпи) по сравнению снеинокулированным контролем. В дальнейшем уровни экспрессии двухгенов оставались выше в варианте с инокуляцией ризобиями (рисунок 52).Среди других генов уровень транскриптов PsIPT4 начинал увеличиваться на5 - 7 дпи и достигал максимума на 11 – 14 дпи (увеличение составило 10 – 15раз) (рисунок 52). Кроме того, у гороха в процессе клубенькообразования на5 - 7 дпи начинала увеличиваться и последовательно возрастала экспрессиягена PsIPT3, но не столь существенно как для PsIPT4 (рисунок 52).Таким образом, нам удалось показать, что у гороха два гена PsIPT1 иPsIPT2, кодирующих изопентениладенин трансферазу (основной ферментбиосинтеза цитокинина) индуцируются в корнях гороха еще до закладкиклубеньков в ответ на инокуляцию (1 – 3 дпи).
Экспрессия этих генов можетбыть связана с наиболее ранними стадиями развития симбиоза. Кроме того,нами были также выявлены гены PsIPT3 и PsIPT4, экспрессия которыхувеличивается в процессе развития клубеньков, начиная с 5 - 7 дня послеинокуляции (при формировании клубеньков).Недавно было показано, что уровень экспрессии отдельных генов,вовлеченных в контроль биосинтеза цитокининов, возрастает в ответ наинокуляцию ризобиями и обработку Nod-факторами и у других бобовых. УM. truncatula после обработки Nod-факторами значительно возрасталаэкспрессия гена MtIPT4 (Medtr2g022140, гомолог гена PsIPT2), кодирующегоизопентенилтрансферазу (van Zeijl et al., 2015). Более того, обработка Nodфакторами индуцировала накопление цитокининов, включая транс-зеатин иизопентенил-аденин, в корнях в течение 3 часов после обработки (van Zeijl etal., 2015).
У Lotus уровень экспрессии гена LjIPT3 (гомолог гена PsIPT3),кодирующего изопентенилтрансферазу, индуцируется в течение трех часовпосле инокуляции ризобиями и достигает максимального уровня на болеепоздних этапах клубенькообразования, что может свидетельствовать онеобходимости цитокининов для клубенькообразования у этого бобового169растения (Chen et al., 2014). Подавление экспрессии гена LjIPT3 приводило кзначительному снижению количества образующихся клубеньков (Chen et al.,2014). Таким образом, полученные нами результаты согласуются с даннымидля других бобовых и свидетельствуют о том, что изменение в содержаниицитокининов при симбиозе может быть связано с биосинтезом этих гормоновв растении в ответ на инокуляцию.На следующем этапе исследований нами был проведен поиск генов угороха, которые контролируют переход цитокининов из неактивной формы(цитокинин-рибозиды) в активную (не рибозилированную).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
