Диссертация (1144752), страница 29
Текст из файла (страница 29)
Следовательно,возможной функцией цитокининов на более поздних стадиях развитиясимбиоза может быть его участие в контроле процессов дифференцировки.Действительно, недавно выполненные исследования показали участиецитокининов в контроле эндоредупликации и дифференцировки тканей вкорнях у модельных растений (Takahashi et al., 2013). Переход клеток кэндоредупликации может непосредственно контролироваться цитокининами,как было недавно показано при изучении Arabidopsis (Takahashi et al., 2013).Таким образом, цитокинины у бобовых растений также могут влиять напроцессы дифференцировки тканей при развитии клубеньков.Другойвозможнойфункциейцитокининоввформирующихсяклубеньках может быть их участие в контроле активации защитных системрастения.
Недавно было показано, что у мутанта бобового растения M.truncatula cre1 по рецептору у цитокининам значительно усиливаютсязащитные системы, что делает его более устойчивым к заражениюфитопатогенами (Laffont et al., 2015). Известно, что у мутантов по гену sym33в ответ на инокуляцию активируются ряд защитных белков и ферментов(Ivanova et al., 2015).
В связи с этим, цитокинины в формирующихсяклубеньках могут быть также необходимы для подавления защитных системрастения, что способствует проникновению ризобий внутрь клеток растенияи развитию внутриклеточной инфекции.186Заключение по части 3.Выполненные нами исследования показали, что у гороха при развитиисимбиоза происходят существенные изменения в содержании гормоновцитокининовиауксинов.Анализтрансгенныхрастений,трансформированных цитокинин-регулируемой репортерной конструкциейpRR4::GUS, выявил локализацию ответа на цитокинины в формирующихсяпримордиях клубеньков. В функционирующих клубеньках ответ нацитокинины был локализован в зоне меристемы, инвазионной зоне и началезоны азотфиксации, что предполагает участие цитокининов не толькоподдержании активности меристемы клубеньков, но и контроле болеепоздних этапов развития симбиоза, связанных с развитием инфекционногопроцесса и дифференцировкой клубенька.
Анализ динамики экспрессиигенов, кодирующих регуляторы цитокининового ответа RR А-типа (PsRR4,PsRR5, PsRR8, PsRR9 и PsRR11), показал, что активация рецептора кцитокининам у гороха может происходитьна нескольких этапах приразвитии симбиотических клубеньков. В ответ на инокуляцию горохаризобиями происходит активация рецептора к цитокининам еще до закладкипримордиев клубеньков, о чем свидетельствует увеличение экспрессии геновпервичного ответа PsRR9 и PsRR11. В формирующихся клубеньках вновьвозрастает уровень экспрессии генов маркеров цитокининового ответаPsRR4, PsRR8 и PsRR11, что свидетельствует о дополнительной стимуляциирецептора. Эти изменения коррелировали с увеличением содержания трансзеатина и изопентениладенина на ранних сроках после инокуляции (1 – 3дпи), а также в формирующихся клубеньках гороха (7 – 11 дпи).Мы показали, что у растений гороха в ответ на инокуляцию на раннихстадиях развития симбиоза (1 – 3 дпи) происходят изменения экспрессиигенов, кодирующих переносчики ауксина PIN2, PIN4 и PIN3, что можетприводить кнарушению полярного187транспорта ауксинов (ПАТ) иперенаправлению потока ауксинов в клетки формирующегося примордия.Действительно,угорохавразвивающихсяпримордияхклубеньковнаблюдается экспрессия ауксин-регулируемой репортерной конструкцииDR5::GUS-NLS, что свидетельствует о локальном накоплении ауксинов.Сходнымобразомунедетерминированногобобовыхтипарастений,(клевер,формирующихлюцерна),вклубенькиразвивающихсяпримордиях наблюдается экспрессия ауксин-регулируемых репортерныхконструкций GH3::GUS и DR5::GUS (Mathesius et al., 1998a; Huo et al., 2006).Таким образом, в результате временного ингибирования ПАТ и локальногонакопления ауксинов в клетках перицикла, эндодермы и внутренней корыможет стимулироваться деление этих клеток.
Следовательно, появлениюклубеньков предшествует создание «максимумов концентрации» ауксинов вклетках, из которых в дальнейшем развиваются примордии этих органов убобовых растений. Создание таких «максимумов» зависит от Nod-факторов иактивации цитокининового ответа в растениях и контролируется за счеттранспорта ауксинов. Влияние цитокининов на белки-транспортеры ауксинаPIN и транспорт ауксина при формировании клубеньков имеет много общегос участием цитокинина в контроле программы развития боковых корней, чтоможет свидетельствовать об эволюционном родстве двух морфогенетическихпрограмм.Важным вопросом являлось выяснение того, что определяет активациюрецептора к цитокининам при развитии симбиоза у гороха – биосинтезцитокининов,ихпереходиз неактивнойформывактивнуюилитранслокация. При изучении генов растения, контролирующих биосинтезцитокининов и их переход из неактивной формы в активную, нами былавыявлена стимуляция экспрессии генов PsIPT1, PsIPT3, PsIPT4 (кодируютизопентениладенин трансферазу) и PsLOG1, 2, 4, 5 (кодируют рибозо-5монофосфатфосфорибогидролазу) у гороха в формирующихся клубеньках.Анализ мутантов с нарушением развития симбиоза показал, что стимуляция188рецептора к цитокинам зависит от биосинтеза этих гормонов в самомрастении за счет ферментов IPT и LOG.
Мы показали, что отсутствиеспособности формировать клубеньки у Nod- мутантов гороха sym7 и sym35коррелирует с отсутствием активации генов биосинтеза цитокининов PsIPT1,PsIPT3, PsIPT4 и PsLOG1, 2, 4, 5, что подтверждает важность именно синтезацитокининов в растениях для активации рецептора к этим гормонам иформирования клубеньков. Напротив, у мутанта по гену sym33 клубенькиформируются и есть увеличение экспрессии PsIPT1 и PsIPT4 генов, чтоподтверждает необходимость синтеза цитокининов для формированияклубеньков.Однако у мутанта по гену sym33, у которого нарушены процессывыхода бактерий из инфекционных нитей в ткани клубенька, отсутствуетактивация генов PsIPT3 и PsLOG1, 2, 4 и 5, а также PsRR11. Таким образом, свыходомбактерийизинфекционныхнитейможетбытьсвязанадополнительная активация рецептора к цитокининам с участием PsIPT3 иPsLOG1, 2, 4, 5 генов.
Возможной функцией цитокининов на более позднихстадиях развития симбиоза может быть их участие в контроле процессовэндоредупликации и дифференцировки тканей клубенька, поскольку недавновыполненные исследования на Arabidopsis показали участие цитокининов вконтроле эндоредупликации и дифференцировки тканей корня (Takahashi etal., 2013). Кроме того, известно, что у мутанта по гену sym33 в ответ наинокуляцию активируется ряд защитных белков и ферментов (Ivanova et al.,2015).
Недавно было показано, что мутанты бобовых растений по рецепторууцитокининуcre1являютсяболееустойчивымикзаражениюфитопатогенами. В связи с этим, возможным следствием накопленияцитокининов в формирующихся клубеньках может быть их участие вподавлении защитных систем растения, что способствует проникновениюризобий внутрь клеток растения и развитию внутриклеточной инфекции.189Часть 4. Изучение роли гомеодомен-содержащих транскрипционныхфакторов KNOX и WOX семейств в формировании клубеньков у гороха.Формированиеудобнуюсимбиотическихмодельдляизученияклубеньковрегуляторныхпредставляетмеханизмов,собойкоторыеконтролируют появление новых органов у растений и их дальнейшееразвитие в ходе онтогенеза.
Клубеньки формируются в результатереактивации отдельных клеток корня, их де-дифференцировки и стимуляцииделения,чтопредполагаетдифференцировки(регуляторовклетокклеточногоучастиеэндогенныхцикла,вконтролерегуляторовфитогормонов,пролиферациисамогоирастениятранскрипционныхфакторов). Механизмы такой регуляции для специализированных органов азотфиксирующих клубеньков – остаются еще далекими от понимания, ноони могут быть достаточно сходными с теми, которые контролируют урастений формирование органов de novo. Это открывает новые перспективыдля изучения органогенеза клубеньков: можно изучать влияние ключевыхрегуляторов пролиферациии дифференцировкиклеток на развитиеклубеньков, участие которых в контроле органогенеза уже исследовано намодельных растениях, например, Arabidopsis.Увысшихрастенийфункционированиемособыхпоявлениеновыхобразовательныхоргановтканейсвязано-смеристем,представленных апикальными меристемами побега (ПАМ) и корня (КАМ), атакже латеральными меристемами (перицикл, прокамбий, камбий, феллоген).Основная функция апикальных и латеральных меристем связана споддержанием пула стволовых клеток, что предполагает тонкую регуляциюпролиферации и дифференцировки клеток (Groover et al., 2006; Aichinger etal., 2012).
Сходство функций может определять участие в контроле этихпроцессов представителей одних и тех же семейств генов в разных типахмеристем. Основную роль в регуляции развития разных типов меристем190играют регуляторы клеточного цикла (циклины и циклин-зависимые киназы),фитогормоны (прежде всего, цитокинины и ауксины), а также гомеодоменсодержащие транскрипционные факторы (ТФ) семейств KNOX (KNOTTED1related homeobox) и WOX (WUSCHEL-related homeobox).Гомеодомен-содержащие ТФ семейства KNOX, представленные двумяклассами у растений – KNOX1 и KNOX2, играют важную роль в регуляцииразвития меристем (Truernit et al., 2006).
Представители KNOX1 классанеобходимыдлярегуляцииразвитияПАМ.СрединихгенSTM(SHOOTMERISTEMLESS) специфично экспрессируется в ПАМ и необходимдля поддержания ее активности, поскольку мутанты с подавлением функцииэтого гена характеризуются значительной редукцией ПАМ, а иногда иполной ее потерей (Endrizzi et al., 1996; Lenhard et al., 2002). Другойпредставитель класса KNOX1 – ген KNAT1 (KNOX of Arabidopsis thaliana)имеет сходный с STM характер экспрессии (Lincoln et al., 1994) и выполняетаналогичную функцию в регуляции развития ПАМ (Byrne et al., 2002).
Болеетого,приповышеннойэкспрессииKNAT1можетвосстанавливатьнарушения, вызванные мутацией в гене stm (Scofield et al., 2013). С ПАМсвязана также функциональная активность KNAT6. Эти данные позволяютсделать вывод о том, что STM, KNAT1 и KNAT6 действуют однонаправленнои подавляют дифференцировку стволовых клеток в ПАМ, стимулируя ихпролиферирующуюактивность.ПредставителисемействаKNOXтранскрипционных факторов могут быть вовлечены и в контроль развитиякорней у растений.
С помощью репортерных конструкций была выявленалокализация KNAT3, 4 и 5 генов (представителей класса KNOX2) в корняхарабидопсиса, что указывает на их участие в развитии этих органов (Truernitet al., 2006).Известно, что в ПАМ ТФ STM и KNAT1 позитивно регулируютэкспрессию генов IPT5 и IPT7, контролирующих первый этап биосинтезацитокининов(Jasinski et al., 2005). В свою очередь, цитокинины191стимулируют экспрессию генов KNOX в ПАМ, тогда как ауксины подавляютих экспрессию (Rupp et al., 1999). Таким образом, влияние ТФ семействаKNOX на гены, контролирующие гормональный баланс растения, лежит воснове регуляции пролиферации и дифференцировки клеток в апикальныхмеристемах.Независимо от KNOX в регуляции пролиферации и дифференцировкиклеток в ПАМ особую роль играет взаимодействие между гомеодоменсодержащим транскрипционным фактором семейства WOX - WUSCHEL(WUS) и регуляторным пептидомCLAVATA3 (CLV3) (Aichinger et al.,2012).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
