Диссертация (1144752), страница 24
Текст из файла (страница 24)
Значительный интерес к использованию олигомеров хитина связансо способностью этих соединений оказывать влияние на развитие симбиоза(n = 4 -5) и повышать устойчивость растений к заражению фитопатогенами (n≥ 6). В связи с этим, олигомеры хитина с определенной степеньюполимеризации могут применяться для обработки растений.Ранее у клубеньковых бактерий был охарактеризован фермент Nацетилглюкозаминилтрансфераза,кодируемыйгеномnodC,которыйконтролирует первый этап в процессе биосинтеза Nod-факторов – синтезхитоолигосахаридов, которые составляют олигосахаридную основу этихсигнальных молекул (Spaink et al., 1991; Denarie et al., 1996). Известно, чтоотдельные виды клубеньковых бактерий способны выделять Nod-факторы,состоящие из строго определенного числа остатков N-ацетилглюкозамина. Вчастности, у бактерий Mesorhizobium loti фермент N-ацетилглюкозаминилтрансфераза способен синтезировать хитоолигосахариды, состоящие строгоиз 5 остатков N-ацетилглюкозамина (Lopez-Lara et al., 2005).
Другой штаммRhizobiumsp.синтезироватьGRH2являетсяединственным,хитоолигосахариды,состоящиеацетилглюкозамина, а также 5 таких остатков149изкоторый6способеностатковN-(Lopez-Lara et al., 2005).Уникальные свойства этих ферментов могут быть использованы прибиосинтетическом способе получения олигомеров хитина, поскольку впроцессебиосинтезаопределенноймогутструктурой.бытьполученыПредложенныйсоединенияспособсополучениястрогоэтихсоединений был связан с конструированием штаммов E.
coli – продуцентовхитоолигосахаридов.2.4.1.Конструированиевекторов,обеспечивающихсинтезхитоолигосахаридов (n = 5 и 6) в бактериях E. coli.Для синтеза хитоолигосахаридов со степенью полимеризации n = 5 и 6,гены nodC двух штаммов ризобий M. loti CIAM1803 и Rhizobium sp. GRH2,кодирующиеферментN-ацетил-глюкозаминилтрансферазу,быликлонированы по сайтам BamH1 и EcoR1 в плазмиде pUC19 под промоторомlacZ (рисунок 43). При гетерологичной экспрессии в штамме E.
coli DH5αгенов nodC M. loti и Rhizobium sp. GRH2, контролирующих синтез этихсоединений, удалось синтезировать олигомеры хитина с необходимойстепенью полимеризации (n = 5 и 6).Рисунок43.Схемаконструированиявекторов,содержащихпоследовательности генов nodC M. loti 1803 и Rhizobium sp. GRH2(Леппянен и др., 2013а; Leppyanen et al., 2014). SP –сигнальный пептид, ТМ –трансмембранный домен.150При культивировании бактерий E. сoli DH5α, содержащих плазмидуpUC19-MlnodC, была получена пента-N-ацетилхитопентаоза (рисунок 44).Кроме того, при культивировании штамма E. сoli DH5α, содержащегоплазмидуpUC19-GRH2nodC,вприсутствиипредшественникаN-ацетилглюкозамина были синтезированы пента-N-ацетилхитопентаоза игекса-N-ацетилхитогексаоза (рисунок 44).
Очистку полученных соединенийпроводили после экстракции из бактерий методомвысокоэффективнойжидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (рисунок 44). С помощью метода массспектрометрии осуществлялианализ синтезированных веществ, которыйподтвердил, что эти вещества являются пента-N-ацетилхитопентаозой игекса-N-ацетилхитогексаозой. Таким образом, в процессе контролируемогосинтеза были получены вещества со степенями полимеризации пять и шестьостатков N-ацетилглюкозамина (Леппянен и др., 2013а; Leppyanen et al.,2014). На следующем этапе работы были изучены свойства этих соединений,сходных по структуре, но отличающихся числом мономерных остатков.Рисунок 44. Анализ синтезированных хитоолигосахаридов с помощьюметода ВЭЖХ на колонке с аминофазой (LC-NH2) (Леппянен и др., 2013а;Leppyanen et al., 2014).2.4.2.Анализбиологическойактивностиполученных биосинтетическим способом.151хитоолигосахаридов,Для проверки биологической активности хитоолигосахаридов быливыбраны растения томата и ячменя, которые согласно литературным данныммогут быть восприимчивы к влиянию гекса- и пентамерных олигомеровхитина (Леппянен и др., 2013б).
Нами было изучено влияние предобработкирастений хитоолигосахаридами, полученными биосинтетическим способом,на развитие устойчивости растений к фитопатогенным грибам Fusariumculmorum. С этой целью 4-5-дневные проростки томата и ячменяобрабатывалирастворамипента-N-ацетилхитопентаозыигекса-N-ацетилхитогексаозы (10-6 М) в течение суток, а затем заражали штаммомфитопатогенного гриба F.
culmorum (Wm. G. Sm.) Sacc. 333. Проводилисравнение с растениями, которые были обработаны водой перед заражениемфитопатогенным грибом. Сравнение также проводили с растениями,обработаннымикоммерческимианалогамихитоолигосахаридов,использованными при тех же концентрациях (10 -6 М) (Леппянен и др.,2013б).Заболеваемость фузариозом проростков томата оценивали на 11 и 17сутки после заражения, а проростков ячменя - на 8 и 17 сутки послезаражения (рисунок 45). При этом симптомы заболевания отдельныхрастений были представлены в баллах (Леппянен и др., 2013б).Былопоказано,фитопатогеннымчтогрибомрастенияF.томатаculmorum,иноячменя,незаражённыеобработанныехитоолигосахаридами, имели четкие симптомы поражения корней гнилями,подавление развития корневой системы, а также надземной части (побегов)(рисунок 45 а, б) (Леппянен и др., 2013б).
Напротив, у растений томата,предварительнообработанныххитоолигосахаридами,признакизаболеваемости практически полностью отсутствовали (рисунок 45 а). Урастенийячменяпослеобработкихитоолигосахаридамипризнакизаболевания были выражены в значительно меньшей степени (рисунок 45 б).152Рисунок 45. Анализ признаков заболеваемости фузариозом у проростковтомата сорта Cormello (а) и ячменя сорта Инари (б), предобработанныххитоолигосахаридами (10-6 М) перед заражением F.
culmorum 333(Леппянен и др., 2013б).Заболеваемость растений оценивали на 8 и 17 день после обработки. Контроль – растенияобработанные водой; Fusarium – растения, зараженные F. culmorum 333; Fus/ХП –растения, зараженные F. culmorum 333 и обработанные пента-N-ацетилхитопентаозой,полученной биосинтетическим способом; Fus/ХПК – растения, зараженные F. culmorum333 и обработанные коммерческой пента-N-ацетилхитопентаозой;Fus/ХГ – растения,зараженные F. culmorum 333 и обработанные гекса-N-ацетилхитогексаозой, полученнойбиосинтетическим способом.Такимобразом,былоисследовановлияниепредобработкихитоолигосахаридами на индукцию устойчивости растений томата и ячменякзаражениюфитопатогеннымигрибами.Былопоказано,чтопредварительная обработка растений хитоолигосахаридами, полученнымибиосинтетическим способом, позволяет значительно уменьшить проявлениепризнаков заболеваемости фузариозом (Леппянен и др., 2013б).153Заключение по части 2.В результате выполненной работы нами была выявлена новая LysMрецепторная киназа Lyk9 – наиболее вероятный кандидат на роль рецептора кхитоолигосахаридам (ХОС) у гороха P.
sativum L. Было показано, чторецепторная киназа Lyk9 активируется в ответ на обработку гороха ХОС сразной степенью полимеризации. Анализ растений с подавлением экспрессиигена PsLyk9 в результате РНК интерференции показал, что они оказалисьболее чувствительными к заражению слабопатогенным штаммом гриба F.culmorum (Wm.G.Sm.) Sacc. 891.
Снижение устойчивости к заражениюкоррелировало с пониженным уровнем экспрессии генов, кодирующихзащитные белки и ферменты (PR1, PR10 и PAL2). Вместе с тем, у растений сподавленной экспрессией PsLyk9 в ответ на обработку ХОС (n = 5),выделяемых грибами АМ, наблюдалось значительное снижение экспрессиигенов, являющихся маркерами развития симбиоза с грибами АМ (DRP, PT4,DELLA, RAM1, NSP2, DWARF27 и TI).
Это позволило сделать вывод о том,что Lyk9 контролирует развитие симбиоза гороха с грибами АМ инепосредственно вовлечена в регуляцию ответных реакций растений надействие ХОС со степенью полимеризации n = 5. Таким образом, рецепторLyk9 определяет развитие устойчивости к фитопатогенам и формированиесимбиоза у гороха. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том,что Lyk9 является наиболее вероятным гомологом рецептора растенийCERK1 (риса и арабидопсиса).
Будет ли данный рецептор формироватькомплексы с другими ко-рецепторами для узнавания хитоолигосахаридов сразной степенью полимеризации, еще предстоит выяснить. Изучениепринципов работы такого рецептора необходимо для понимания того, как урастений формируется симбиоз или, напротив, индуцируется системаустойчивости, препятствующая развитию внутриклеточной инфекции.154Часть 3. Анализ взаимодействия компонентов сигнального каскада,активируемого Nod-факторами, с фитогормонами при симбиозе.Приклубенькообразованииубобовыхрастенийпараллельнопротекают события в разных типах тканей – эпидермисе (инициируетсябактериальная инфекция) и коре корня (стимулируются деления клеток, чтоприводит к органогенезу клубенька).
Генетический анализ показывает, чтоэти события взаимосвязаны, но контролируются разными наборами генов(Borisov et al., 2000; Tsyganov et al., 2002). В связи с тем, что Nod-факторыостаются связанными с клеточной стенкой клеток корневых волосков и непроникают в клетки коры корня (Goedhard et al., 2000), была предложенагипотеза «вторичного мобильного сигнала», который активируется впроцессе передачи сигнала от Nod-факторов в клетках эпидермиса ипередается в клетки коры (Oldroyd and Downie, 2008; Hirsch and Oldroyd,2009).
Роль таких мобильных сигналов могут выполнять гормоны, а такжетранскрипционные факторы, которые действуют не клеточно-автономнымобразом (могут перемещаться).Важную роль в передаче сигнала от Nod-факторов после компонентов«общегосигнальногопути»играюттранскрипционныефакторы:MtIPD3/LjCYCLOPS/ PsSym33, MtNSP1/LjNSP1/PsSym34, MtNSP2/LjNSP2/PsSym7, MtNIN/LjNIN/PsSym35, MtNF-Y1(HAP2)/ LjNF-YA1 и MtNFY2/LjNF-Y2 (CAAT-бокс связывающие ТФ), MtERN1 и MtERN2 (Schauser etal., 1999; Kaló et al., 2005; Smit et al., 2005; Andriankaja et al., 2007; Marsh etal., 2007; Middleton et al., 2007; Yano et al., 2008; Ovchinnikova et al., 2011;Soyano et al., 2013; Singh et al., 2014; Laloum et al., 2014).
Необходимость этихрегуляторов для контроля симбиоза была подтверждена на основаниианализамутантоврастенийпогенамтранскрипционныхфакторов,характеризующихся нарушением способности формировать клубеньки (Nodфенотип), либо имеющих нефункциональные клубеньки (Fix- фенотип).155Долгое время доминировала точка зрения о том, что только комплекстранскрипционных факторов, активируемых в ходе передачи сигнала от Nodфакторов необходим и достаточен для контроля клубенькообразования.Однако были получены убедительные доказательства участия в контролеклубенькообразования и эндогенных регуляторных молекул самого растения– фитогормонов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
