Диссертация (1144752), страница 22
Текст из файла (страница 22)
benthamiana). Это свидетельствует о том, что рецепторныйкомплекс к Nod-фактору, в состав которого входит Sym10, являетсягетеромерным, то есть состоящим из двух белков-рецепторов, один изкоторых обладает функциональным киназным доменом. Использованныйнамидляанализавзаимодействиярецепторовметодявляетсямоделированием в гетерологичной системе сборки рецепторного комплекса,которая может происходить in vivo в растениях. In vivo в клетках растениймембранных рецепторов содержится очень мало, поэтому у большинстватакихрецепторовсборкагетеро-илигомоолигомерногокомплексапроисходит только под влиянием лиганда, когда один из рецепторовсвязывается с лигандом, меняет свою конформацию и в результате этогостановится способным связываться с другой белковой молекулой.
В134результате же синтеза под промотором 35S в листьях N. benthamiana(сверхэкспрессия), рецепторов в клетках нарабатывается достаточно много иумолекулбелков-рецепторовпоявляетсявозможностьфизическоговзаимодействия в мембранах. Сборка рецепторного комплекса происходит вэтом случае даже в отсутствии лиганда, но только между определенными«комплементарными» рецепторами. Это позволяет сделать вывод о том, что врецепторных белках имеются участки связывания не только с лигандом, но ив самих белковых молекулах есть участки, определяющие их способностьформировать комплексы.Мы показали, что рецептор Sym10 способен объединяться и с К1 и сSym37.
Поскольку ранее мы отмечали, что у мутантов по генам Sym10 иSym37 блокируются разные этапы развития симбиоза, то можно предложитьследующееобъяснениеполученнымданным.Присимбиоземожетпроисходить последовательная сборка сначала одного комплекса Sym10/K1(инициация симбиоза), а затем формируется комплекс Sym10/ Sym37(контролирует развитие инфекционного процесса).Другой важный вопрос: может ли Sym10 входить в состав разныхкомплексов и под влиянием каких факторов может происходить сборка/разборка разных комплексов с участием одного и того же рецептора? Умутанта по гену sym10 полностью отсутствуют признаки развития симбиоза,чтосвидетельствуетоработеэтогорецептораприинициацииклубенькообразования. Таким же фенотипом характеризуется рецептор NFP(гомолог Sym10 у M. truncatula).
Однако при получении растений сподавленной экспрессией белка NFP (то есть частичным подавлениемфункции рецептора в результате РНК-интерференции), у трансгенныхрастений ранние этапы развития симбиоза развивались, но нарушалосьформирование инфекционных нитей. Следовательно, данный тип рецепторовможет контролировать не только инициацию симбиоза, но и развитиеинфекции у двух видов бобовых, характеризующихся сходным процессом135клубенькообразования.
Это свидетельствует в пользу предположения о том,что NFP и Sym10 могут работать на разных этапах развития симбиоза – какна преинфекционной стадии, так и при развитии инфекции.Наконец, что может вызывать сборку разных комплексов? Вероятно,это могут быть изменения в концентрации Nod-факторов. Так на раннихстадиях бактерии в почве выделяют Nod-факторы в концентрации 10-13 – 10-9М.
После формировании микроколонии ризобий в скрученном корневомволоске концентрация Nod-факторов возрастает до 10-6 М. Это можетявляться стимулом для формирования нового рецепторного комплекса.Кроме того, известно, что Nod-факторы достаточно быстро расщепляютсяспецифичными ферментами растений до ди- и тримеров (Ovtsyna et al., 2005).Появление Nod-факторов с другой структурой также может быть стимуломдля формирования нового комплекса.136Заключение по части 1.Таким образом, на основании анализа экспрессии генов нодулиновPsEnod5 и PsEnod12a у серии мутантов гороха, характеризующихсянарушением развития симбиоза на различных стадиях, нами были полученыэкспериментальные доказательства активации двух разных сигнальных путейпри узнавании Nod-факторов. Эти данные свидетельствуют в пользупредположения о том, что у гороха рецепция Nod-факторов можетконтролироваться разными рецепторными комплексами и осуществляется надвух последовательных этапах развития симбиоза – на преинфекционнойстадии и при развитии инфекционного процесса.Нами был осуществлен синтез рецептор-подобных киназ Sym10 иSym37 в гетерологичной (бактерии E.
coli) и гомологичной (листья N.benthamiana) системах, что позволило наработать очищенные белки вколичестве, достаточном для анализа их связывающей способности с Nodфакторами. В бактериях E. coli был осуществлен синтез внеклеточныхдоменов рецепторов Sym10 и Sym37 в растворимой форме с помощьюпредложенного нами нового подхода. Вместе с тем в листьях N. benthamianaбылисинтезированыполноразмерныебелкиSym10иSym37снеобходимыми модификациями, для которых был также проведен анализсвязывания с лигандом.
Однако в результате проведенных исследований длявнеклеточных доменов рецепторов, синтезированных в бактериях, а такжедля полноразмерных белков-рецепторов, синтезированных в листьях N.benthamiana, была показана низкая связывающая способность с Nodфакторами. Тем не менее, генетический анализ мутантов по генам sym10 иsym37 убедительно свидетельствовал о необходимости этих двух LysM-РПКдля инициации симбиоза.
Это указывало на существование дополнительныхрецепторов в составе рецепторных комплексов, имеющих более высокоесродство к Nod-факторам и контролирующих реакцию растений на узнаваниеэтих сигнальных молекул.137Нами была изучена новая LysM-рецептор-подобная киназа К1 иполучены данные о том, что LysM-РПК К1 может формировать комплекс сбелкомSym10,тоестьбылапоказанавозможностьфизическоговзаимодействия двух белков при ко-экспрессии в листьях N.
benthamiana. Всилу того, что у Sym10 киназный домен не является активным,формирование димерного рецепторного комплекса с К1, может являтьсянеобходимым для связывания Nod-факторов в корнях гороха при симбиозе сризобиями. В пользу этого свидетельствуют и данные молекулярногодокинга о способности LysM-РПК К1 связывать Nod-фактор.Сходной способностью обладал также рецептор Sym37, который прико-экспрессии в листьях N. benthamiana вместе с Sym10 также вызывалразвитие реакции гиперчувствительности. Таким образом, функционально К1и Sym37 способны выполнять сходную функцию: быть одним изкомпонентов рецепторного комплекса к Nod-факторам.
Однако поскольку умутанта по гену Sym37 ранние этапы развития симбиоза не блокируются, вотличие мутантов по гена sym10 и k1, то более вероятной представляетсясборка комплекса Sym10/К1 на начальных этапах развития симбиоза. Тогдакак сборка другого комплекса Sym10/Sym37 может быть необходимой длязапуска инфекционного процесса (процесса развития инфекционных нитей,посредством которых бактерии проникают во внутренние клетки коры)(рисунок 36).Рисунок 36. Модель функционирования рецепторов к Nod-фактораму гороха.138Часть2.Поискугорохапотенциальныхрецепторовкхитоолигосахаридам с разной степенью полимеризации, необходимыхдля развития симбиоза и активации защитных систем растения.Большой интерес для нас представлял поиск у гороха рецепторов,способныхразличатьсимбиотическимиихитоолигосахаридныефитопатогеннымисигналы,выделяемыемикроорганизмами.Ранеевыполненные исследования на рисе и арабидопсисе позволили выявитьпервые рецепторные белки, участвующие в связывании хитоолигосахаридов(ХОС) и играющие важную роль в иммунитете растений.
Это рецепторподобные киназы, содержащие во внеклеточном домене LysM-мотивы(LysM-РПК): OsCERK1 и OsCEBiP у риса, а также AtCERK1 и AtLYK5 уарабидопсиса (Kaku et al., 2006; Miya et al., 2007; Wan et al., 2008; Iizasa, 2010;Shimizu et al., 2010; Liu et al., 2012; de Mita et al., 2013; Miyata et al, 2014).Несколько позже CERK1-подобный рецептор SlBti9 был выявлен у томата, аCEBiP-подобный рецептор HvCEBiP - у ячменя (Tanaka et al., 2010; Zeng etal., 2012). У представителей бобовых растений в настоящее времяотсутствует какая-либо информация о CERK1- иCEBiP-подобныхрецепторах.
Известно, что при связывании хитоолигосахаридов (n = 8) у рисаформируется гетеродимерный комплекс OsCEBiP/OsCERK1, а у Arabidopsis гомодимерный и гетеродимерный комплексы - AtCERK1/AtCERK1 иAtCERK1/AtLYK5 (Liu et al., 2012; Miyata et al, 2014).У Arabidopsis, который не формирует симбиозов с грибами АМ,рецептор AtCERK1 необходим только для активации защитных реакций приобработке ХОС или при взаимодействии с фитопатогенными грибами (Liu etal., 2012). Напротив, у риса OsCERK1 рецептор выполняет двойную функцию– не только участвует в активации защитных систем растения при рецепцииолигомеров хитина со степенью полимеризации (n = 8), но и контролируетразвитие симбиоза с грибами АМ при связывании коротких олигомеров139хитина (n = 4 - 5) (Miyata et al., 2014).
Подавление с помощью РНКинтерференции экспрессии OsCERK1 приводило к значительной редукцииАМ колонизации (Zhang et al., 2015). При этом ко-рецептор OsCERK1,который необходим для связывания олигомеров хитина (n = 4 -5), остаетсянеизвестным. Таким образом, рецептор CERK1 может быть тем уникальнымрецептором, на уровне которого собственно и происходит различениесигналов хитоолигосахаридной природы от симбиотических и патогенныхмикроорганизмов.В связи с этим особый интерес для нас представлял поиск и изучениеCERK1-подобных рецепторов у бобового растения гороха P. sativum L.,посколькуэтирецепторымогутучаствоватьвсвязываниихитоолигосахаридов с разной степенью полимеризации, вызывающихактивацию защитных систем растения и/или развитие симбиоза.Задачами данного раздела исследований являлись:1.Поиск и изучение потенциальных рецепторов к хитоолигосахаридам сразной степенью полимеризации у гороха P.
sativum L.2.Анализ участия рецепторных белков-кандидатов в контроле развитиясимбиоза с грибами арбускулярной микоризы.3.Анализвлияниярецепторныхбелков-кандидатовнаразвитиеустойчивости гороха к фитопатогенным грибам.4.Получение хитоолигосахаридов с разной степенью полимеризации спомощью биологического синтеза.2.1. Поискиизучениепотенциальныхрецепторовкхитоолигосахаридам с разной степенью полимеризации у гороха P.sativum L.140Геном гороха не расшифрован, что затрудняет поиск и идентификациюгенов. У арабидопсиса и риса CERK1 представляет собой LysM-содержащуюрецептор-подобную киназу. Рецепторы этого типа у бобовых растенийотносятся к семейству LYK (LysM-содержащие рецепторы с полноценнымикиназными доменами), поэтому на первом этапе исследований намнеобходимо было выявить у гороха гомологи генов Lyk двух модельныхрастений M.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
