Диссертация (1144752), страница 18
Текст из файла (страница 18)
Сходные результаты были получены при анализе экспрессии генанодулина Enod11 у мутантов M. truncatula по гомологичным генам MtDMI2(PsSym19), MtDMI1 (PsSym8), MtDMI3 (PsSym9) и MtNSP2 (PsSym7) (Mitra etal., 2004b).Напротив, в дополнение к мутантам по генам sym10, sym19, sym9 и sym7,экспрессия PsEnod5 не увеличивалась у мутантов по генам sym35 (SGENod-3) и sym14 (E135N), у которых наблюдали скручивания корневых волосков иформирование микроколоний, но не было развития инфекционных нитей.
Умутантов по этим генам также отсутствовали деления кортикальных клеток изакладка примордиев клубеньков. Мы также не выявили экспрессии PsEnod5у мутантов гороха по генам sym34 (RisNod23) и низкий уровень экспрессии уsym16 (R50), у которых рост инфекционных нитей останавливался в клеткахнаружной коры корня, а формирование примордиев клубеньков прерывалосьеще на стадии начальных делений клеток коры. Однако этот гениндуцировался у мутанта sym5 (R88), у которого процесс инфицированияпроходил до более продвинутых стадий, но блокирование развитияпримордиев клубеньков также наблюдалось на самых ранних стадиях(рисунок 17б и 18).Вместе с тем, ген PsEnod5 экспрессировался у мутантов по генам sym36(RisNod26) и sym38 (SGENod--8), у которых рост инфекционных нитейпрекращался на более ранней стадии (в клетках корневых волосков) посравнению с sym34 и sym16, но органогенез клубеньков проходил до болеепоздней стадии – развитие прекращалось на стадии формирования непримордия, а меристемы клубенька.
Таким образом, мы показали, чтоиндукция экспрессии гена нодулина PsEnod5 зависит как от компонентов«общего сигнального пути», активируемого Nod-факторами, так и отдополнительных регуляторных генов, вовлеченных в передачу сигнала отNod-фактора. Эти результаты соответствуют данным in situ гибридизации,105согласно которым гены нодулинов PsEnod12а и PsEnod5 регулируются поразному при симбиозе (Scheres et al., 1990a). Использование экспрессииPsEnod5 в качестве молекулярного маркера позволило нам разделитьвыявленные у гороха Sym гены (ранее не охарактеризованные у модельныхбобовых) на две группы и предложить модель, согласно которой послеактивации «общих» генов PsSym10 – PsSym19 – PsSym8 – PsSym9, а такжеPsSym7 в передачу сигнала вовлекаются две различные группы генов:PsSym35, PsSym14, PsSym34 и PsSym16 (с одной стороны) и PsSym36,PsSym38 (с другой) (Dolgikh et al., 2011).Эти результаты также согласуются с данными, которые были полученыпри сравнительном анализе особенностей развития симбиоза у мутантов поэтим генам (Tsyganov et al., 2002).
Фенотипическая характеристика мутантовпозволила сделать аналогичный вывод о том, что у гороха две группы геновPsSym36, PsSym38 (одна группа) и PsSym35, PsSym14, PsSym34, PsSym16(другая группа) контролируют процесс развития инфекции и органогенезклубеньков, при этом они действуют параллельно, но зависимым друг отдруга образом (Tsyganov et al., 2002).
Таким образом, PsEnod5 являетсямаркером активации одной из этих групп генов. Так как нодулин выявляетсятолько в клетках, в которые проникли инфекционные нити, то он можетслужить маркером сигнального пути, который активируется рецепторнымкомплексом, контролирующим рост и развитие инфекционных нитей.1.1.2. Анализ участия рецептор-подобных киназ Sym10 и Sym37 вактивации сигнальных путей у гороха.Наконец, мы изучили, какую роль в активации экспрессии нодулиновPsEnod5 and PsEnod12a играют рецепторные киназы Sym10 и Sym37. Анализэкспрессии нодулинов у мутанта по гену sym10, кодирующему LysM-РПК,показал, что этот рецепторный белок абсолютно необходим для активации106экспрессии PsEnod5 и PsEnod12a (рисунок 19) (Dolgikh et al., 2011).
Такойрезультат был ожидаем, поскольку у мутанта по гену sym10 отсутствуюткакие-либо реакции в ответ на обработку Nod-факторами или инокуляциюризобиями. В нашем распоряжении имелись также две мутантные линиигороха по гену sym37 (RisNod4 и K24), кодирующему LysM-РПК другоготипа, у которых ранние реакции на действие Nod-факторов проявлялись, ноформирование инфекционных нитей было блокировано на начальной стадии.Рисунок 19. Экспрессия генов PsEnod12a и PsEnod5 у мутантных линийгороха K24 (sym37) и P56 (sym10), инокулированных R.l.v. CIAM 1026.ПЦР продукты были собраны после 26 циклов амплификации и разделены в 1.5%агарозном геле. Экспрессия убиквитина (Ub) была использована для стандартизацииколичеств кДНК между образцами.У двух мутантов по гену sym37 мы не выявили активации экспрессиигена PsEnod5 (рисунок 19). Это показывает, что индукция этого гена строгозависит от присутствия функциональной LysM-РПК, кодируемой геномPsSym37.
Напротив, в ответ на инокуляцию экспрессия PsEnod12a возрасталау мутантов K24 и RisNod4 (sym37), хотя уровень индукции был ниже у этихмутантных растений по сравнению с диким типом (рисунок 19). Этопозволило в соответствии с нашими предположениями сделать вывод о том,что экспрессия гена PsEnod5 у гороха непосредственно зависит от активациирецептора Sym37.Таким образом, целью данного раздела исследований было выявитьсвязь между экспрессией симбиоз-специфичных генов нодулинов и107активацией компонентов сигнального каскада в ответ на рецепцию Nodфакторов при развитии симбиоза.
Мы также проанализировали роль двухLysM-рецептор-подобных киназ Sym10 и Sym37 в регуляции этих процессов.Ранее для пяти генов - PsSym10, PsSym19, PsSym8, PsSym9 и PsSym7, которыевовлечены в ранние этапы передачи сигнала после рецепции Nod-факторов,был определен порядок их вовлечения в сигнальный путь на основе анализаморфологических,физиологическихиферментативныхответов,активируемых Nod-факторами (Walker et al., 2000; Ovtsyna et al., 2005). Мыпоказали, что транскрипционная активация генов ранних нодулинов PsEnod5и PsEnod12a в ответ на инокуляцию ризобиями может служить в качестведополнительных маркеров для разделения компонентов сигнальных путей.Транскрипционнаяактивацияобоихгеновнодулиновзависитотфункционирования Sym10, Sym19, Sym8, Sym9 и Sym7 компонентовсигнального пути.
Это показывает, что консервативный сигнальный модуль,включающий компоненты от LysM-РПК, кодируемой геном PsSym10, доCCaMK, кодируемой геном PsSym9, являются необходимыми для активациисимбиоз-специфичных генов у гороха в ответ на рецепцию Nod-факторов(рисунок 20) (Dolgikh et al., 2011). Данные о том, что транскрипционныйфактор NIN, кодируемый геном PsSym35 (ортолог Lj/MtNIN), не требуетсядля активации PsEnod12a, согласуются с данными анализа гомологичногогена MtENOD11 у Medicago, выполняющего сходную функцию, дляактивации которого также не требуется транскрипционный фактор NIN(March et al., 2007).Среди двух генов, исследованных нами, ген PsEnod5 регулируетсяболее строгим образом:для его активациинеобходим не толькоконсервативный модуль Sym10-Sym9 и Sym7, но также Sym35 (NINтранскрипционный фактор), Sym34, Sym14 и Sym16.
Это выявленное внашем исследовании наличие дополнительных компонентов в сигнальномкаскаде,ведущемкактивацииPsEnod5,108хорошосогласуетсяспредварительно полученными данными по in situ гибридизации, которыепоказали различную локализацию экспрессии двух генов PsEnod12a иPsEnod5 у гороха (Scheres et al., 1990a). Наконец, мы получили данные о том,что для индукции экспрессии PsEnod5 необходим функциональный рецепторSym37, который, по-видимому, активирует целую группу регуляторныхгенов, определяющих развитие более поздних этапов симбиоза, связанных синфекцией и органогенезом клубеньков.Рисунок 20. Схема вовлечения в передачу сигнала компонентов пути,активируемого Nod-факторами у M.
truncatula, L. japonicus и P. sativum(Dolgikh et al., 2011). Порядок вовлечения в передачу сигнала регуляторных генов угороха был определен на основании анализа у мутантов экспрессии двух молекулярныхмаркеров - PsEnod12a и PsEnod5.Действительно данные по экспрессии PsEnod5 у мутантов указывают нато, что после стадии, контролируемой Ca2+, кальмодулин-зависимой киназой,в дальнейшую передачу сигнала вовлечены две группы генов, необходимые109для регуляции развития инфекции и морфогенеза клубеньков у гороха,которые функционируют параллельно.
Только одна из этих групп геновнеобходима для активации экспрессии PsEnod5.1.2. Изучение биохимической функции рецептор-подобных киназ горохаSym10 и Sym37, необходимых для развития симбиоза.Как уже было отмечено нами ранее, поиск возможных кандидатов нароль рецепторов к Nod-факторам у модельных бобовых растений был связанс выявлением и изучением мутантов, невосприимчивых к инокуляции ивлиянию Nod-факторов и дефектных по генам, кодирующим особый классрецепторных киназ с LysM-мотивами во внеклеточных доменах.
У гороха P.sativum L. анализ подобных мутантов позволил выявить два наиболеевероятных кандидата на роль рецепторов к Nod-факторам - LysM-РПК,кодируемые генами PsSym10 и PsSym37. Наличие LysM-мотивов в LysMРПК Sym10 и Sym37 позволяет отнести их к классу рецепторов,связывающих Nod-факторы, поскольку эти мотивы присутствуют в белках,узнающих хитино-подобные молекулы (Liu et al., 2012). Однако, несмотря напотенциальную возможность связывания LysM-РПК с Nod-факторами,физическое взаимодействие между этими молекулами и LysM-РПК Sym10 иSym37, которое должно подтвердить биохимическую функцию рецепторов, внастоящее время показано не было.
В связи с этим нами были проведеныисследования по функциональной характеристике белков – кандидатов нароль рецепторов к Nod-факторам у гороха. Для изучения связывающейспособности с Nod-факторами был осуществлен синтез LysM-РПК Sym10 иSym37вразличныхгетерологичныхвзаимодействия этих белков с лигандом.110системахипроведенанализ1.2.1. Синтез внеклеточных доменов рецептор-подобных киназ Sym10 иSym37 гороха в бактериальной системе и анализ их связывающейспособности с лигандом.Из-за трудности выделениямембранных белков из тканейвдостаточных количествах (такие рецепторы обычно присутствуют в оченьнизкихконцентрациях),методическиеподходынеобходимодляихбылонаработки.разработатьСэтойспециальныецельюобычноосуществляют гетерологичную экспрессию генов, кодирующих белкиинтереса, в бактериях E.
coli, дрожжах Saсcharomyces cerevisiae или Pichiapastoris (последние имеют тип гликозилирования сходный с высшимирастениями) или растениях (например, Nicothiana benthamiana). Удобнойсистемой для экспрессии могут быть бактерии E. coli, поскольку в них можнополучить достаточно большие количества рекомбинантных белков. Однакопри синтезе эукариотических белков в клетках прокариот, в этихсинтезируемых белковых молекулах отсутствуют вторичные модификации,такие как гликозилирование, фосфорилирование и т.п.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
