Диссертация (1144752), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Для выяснения этоговопроса необходимо было детально изучить белки-рецепторы, которые поданным генетического анализа могут быть вовлечены в связывание Nodфакторов,Myc-факторовихитоолигосахаридов84сразнойстепеньюполимеризации, выяснить их организацию и возможный механизм рецепциисигнальных молекул.У бобовых растений осуществляется тесная интеграция процессов,протекающих в эпидерме и коре корня, что может быть связано с влияниемгормонов и транскрипционных факторов, способных перемещаться. Приэтом неразрешенным остается вопрос о том, как взаимодействуют междусобой компоненты сигнального пути, активируемые Nod-факторами ифитогормоны, а также каким образом осуществляется передача сигнала отNod-фактора в клетки корня с участием этих регуляторов и почемуизменяется содержание фитогормонов при симбиозе.Как контролируется пролиферация и дифференцировка клеток приформировании новых органов - клубеньков, которые появляются у растенийde novo под влиянием сигналом ризобий? Используются ли при этомпрограммы, которые заложены в самом растении, например, программаразвития бокового корня, или активируются новые? Так как клубенькивозниклиотносительнонедавно,топрограммаихразвитиямогласформироваться на основе уже существующих процессов и наиболеевероятно тех, которые вовлечены в развитие боковых корней (Hirsch andLaRue,1997).Этосвидетельствуетонеобходимостидальнейшихисследований.У растений регуляция органогенеза клубеньков осуществляется каклокально, так и системно.
Остаются далекими от понимания механизмысистемной регуляции симбиоза (которую принято называть авторегуляциясимбиоза), хотя отдельные компоненты этой системы (рецепторы CLAVATAи CLE-регуляторные пептиды) выявлены у модельных бобовых растений.Необходимо выяснить, на какие мишени в корне растения действует сигнал,появляющийся в побеге растения после взаимодействия с системойрецепторов CLV1, CLV2 и KLV и перемещающийся в корень. Известно, чтоу модельных растений в апикальной меристеме побега транскрипционный85фактор WUS (представитель семейства WOX) вовлечен как в локальную, таки в системную регуляцию пролиферации клеток.
Такая регуляцияосуществляется через взаимодействие транскрипционного фактора WUS ссистемой CLAVATA и регуляторами цитокининового ответа растений.Может ли подобное взаимодействие осуществляться и при системнойрегуляции клубенькообразования? Для ответа на этот вопрос необходимодальнейшееизучениесигнальногоклубенькообразования.86обменаприавторегуляцииГлава II. Методические подходы.2.1. Штаммы микроорганизмов.Для инокуляции растений гороха использовали штамм Rhizobiumleguminosarum bv. viciae CIAM1026 из коллекции ФГБНУ ВНИИСХМ(WDCM 966).
Для трансформации гороха использовали штамм Agrobacteriumrhizogenes Arqua. Для молекулярно-биологических исследований былииспользованы штаммы E. coli TOP10, DH10B и DH5α (Invitrogen, США).2.2. Растительный материал.В работе были использованы линии гороха (Pisum sativum L.) изгенетической коллекции института ФГБНУ ВНИИСХМ эффективная пофиксацииазоталинияFrisson(DucandMessager,1989)исуперклубенькообразующие мутантные линии P88 (sym 29) и P64 (sym 28);эффективная линия SGE (Kosterin, Rozov, 1993) и мутантные линии SGENod-1 (sym35), SGENod--6 (sym7), SGEFix--1 и SGEFix--6 (sym40), SGEFix--2 иSGEFix--5 (sym33), полученные на основе одного исходного генотипа SGE(Tsyganov et.al., 1998, 2002).2.3. Условия выращивания растений.Семена гороха Pisum sativum L.
стерилизовали в течение 5 мин вконцентрированной серной кислоте, отмывали 3 раза водой, переносили на1% водный агар и проращивали в темноте при комнатной температуре. 4 – 5дневные проростки гороха переносили в горшки с вермикулитом, политыепитательной средой Jensen (van Brussel et al., 1982). Инокуляцию семянпроводили водной суспензией бактерий (OD600 = 0.5) на растение.Дляэкспериментовпоанализуэкспрессиигеноввдинамикерастительный материал собирали, начиная с 1 дпи (дня после инокуляции) идалее с интервалом в два дня.
На 3 и 5 сутки у линии гороха SGE брали87корни, на 7 и 9 сутки (после появления клубеньков) собирали клубеньки снебольшими участками корня (2-3 мм), на 11 сутки и далее собираликлубеньки. В качестве контроля использовали неинокулированые корни,собранные на тех же сроках. Растительный материал использовали в свежемвиде либо после кратковременного хранения при -70оС.2.4. Получение растительных экстрактов.Растительные ткани гомогенизировали в буфере для экстракции,содержащем 100 мМ MES-KOH (рН 7.2), 3% этиленгликоль, 1 мМ ЭДТА,0,1% сахарозу, 5 мМ дитиотрейтол, 0,1 мМ фенилметилсульфонилфторид(ФМСФ).Дляполученияэкстрактов50–100мгклубеньковгомогенизировали в 500 мкл буфера, 1 г листьев и корней - в 1000 мкл.
Всепроцедуры по выделению белков проводили при +4 оС. Центрифугированиеосуществляли при +4оС (14000 g, 40 мин) на центрифуге "Hettich Micro22R".Супернатантиспользовалидляпроведениягель-электрофорезасдодецилсульфатом натрия (ДСН).2.5. Вестерн-блот-анализ.Белковые образцы (10 - 40 мкг) разделяли электрофоретически в ДСНПААГ по методу Laemmli (Laemmli, 1970) и переносили на нитроцеллюлозу.Для инкубации использовали специфичные моноклональные антитела антиFLAG M2, конъюгированные с пероксидазой (Sigma-Aldrich, США) приразведении 1:5000 или поликлональные антитела анти-RPF(Thermoscientific, USA), разведенные 1:2000. Для визуализации полос преципитацииприменяли антитела против IgG кролика, конъюгированные с пероксидазой1:5000 (Sigma-Aldrich, USA). Выявление продуктов реакции проводили спомощью хемилюминисцентного красителя Immobilon (Millipore, США).2.6.
Трансформация бактерий.88Для трансформации E.coli плазмидной ДНК использовали метод сприменением хлористого кальция (Sambroock et.al., 1984). Для дальнейшейработы использовали клетки с компетентностью не ниже 5·107 – 108клеток/мкг плазмиды. Компетентные клетки E. coli DH5α получали пометоду, описанному Inoue и соавторами (Inoue et al., 1990).2.7. Выделение плазмидной ДНК.Для минипрепаративного выделения плазмидной ДНК использовалиметод, адаптированный для небольших объемов бактериальной суспензии (2мл) (Sambroock et.al., 1989).
Центрифугирование со скоростями до 5000об/мин проводили на центрифуге «Beckman» (объемы до 250 мл), а соскоростями от 5000 до 20000 об/мин - на центрифуге «Hettich Micro22R»(объемыдо2ультрацентрифугемл)."TL-100УльтрацентрифугированиеприBeckman"100проводили000об/мин,на4оС.Секвенирование нуклеотидных последовательностей проводили по методуSanger с соавт. (Sanger et al., 1977) при использовании Sequenase 2.0 (TermoScientific, USA).2.8.
Выделение растительной ДНК.Суммарную ДНК растений выделяли из вегетативных частей растений сиспользованиембуфера,содержащегоцетилтриметиламмонийбромид(ЦТАБ) (Murray, Thompson, 1980). Для этого растения гомогененизировали вжидкомазоте,затеминкубироваливэкстракционномбуфере(2хэкстракционный буфер содержит 100 mM трис-HCl, pH 8,0, 20 mM EDTA,2% w/v ЦTAB, 1,4 M NaCl, 20 mM 2-β-меркаптоэтанол) при 60o C в течение15 минут, дважды экстрагировали смесью хлороформ/изоамиловый спирт(24:1) и центрифугировали при 14000 g в течение 10 минут.
Водную фазусмешивали с двумя объемами буфера для осаждения (50 мМ трис-HCl, pH8,0, 10 мМ EDTA, 1% вес/об. ЦTAB), инкубировали в течение 15 минут, а89затем центрифугировали при 14000 g. Осадок промывали водой и растворялив 1,5 M NaCl. Ферментативную обработку РНКазой проводили в течение 30минут при 37oC. Осаждение ДНК проводили с добавление 2 объемов 90%этанола.
Осажденную ДНК промывали 70% этанолом и растворяли в 50 мклводы. Выделенную ДНК разгоняли в 1,5% агарозном геле на буфере ТАЕ (1х)с последующим окрашиванием бромистым этидием.2.9. Количественный анализ экспрессии генов с помощью ОТ-ПЦРс детекцией в реальном времени.Суммарная РНК была изолирована из корней и клубеньков гороха спомощью реактива Trizol (Life Technologies, США) согласно инструкциипроизводителя. После обработки ДНКазой (Thermo Scientific, США),образцы были экстрагированы с помощью равного объема хлороформа, иРНК была осаждена из водной фазы с помощью 3 M ацетата Na и этанола.Содержание РНК оценивали спектрофотометрически на спектрофотометре(Shimadzu, Япония).
РНК (1 – 2,5 мкг) была использована для синтеза кДНК спомощью обратной транскриптазы (Thermo Scientific, США). ОТ-ПЦР былпроведен на амплификаторе CFX-96 (Bio-Rad Laboratories, США) сиспользованием SYBR Green красителя (Bio-Rad Laboratories, США).Реакцию проводили в объеме 20 мкл, содержащем 1X буфер для ПЦР, 4 мМMgCl2, 10 мМ дНТФ, 1 ед.
Taq-полимеразы «jumpstart», 10 пМ каждогопраймера и 0,5xSYBR Green I. Амплификацию проводили по следующейпрограмме: 95oC в течение 30 сек, 54oC в течение 30 сек и 72oC в течение 40сек.ФлуоресценциюинтеркалирующегокрасителяSYBRGreenIрегистрировали в конце каждого цикла при 72oC. Значения порогового цикла(CT) были получены с помощью программы CFX-96 и проанализированы спомощью 2-ΔΔCt метода (Livak and Schmittgen, 2001). Данные поколичественной оценке анализируемого гена представлены в относительныхединицах, рассчитанных при сравнении с уровнем экспрессии референсного90гена убиквитина, планки погрешностей указывают стандартные отклонения.Для каждого образца реакцию проводили в трех повторностях.
Праймеры дляпроведения ПЦР были подобраны с помощью программы Vector NTI исинтезированы компанией Evrogen (www.evrogen.com). Специфичность ПЦРамплификации была проверена с помощью построения кривой диссоциации(55–95°C).2.10.Анализвзаимодействиябелковприкратковременнойэкспрессии в листьях Nicothiana benthamiana.Штаммы A. tumefaciens LBA 4404 или GV3101, содержащие векторыдля экспрессии полноразмерных генов, кодирующихрецептор-подобныекиназы, были инфильтрованы в листья N.
benthamiana. Бактериальныекультуры были выращены при 28ºC в течение ночи, центрифугированы при3000 g и ресуспендированы в 10 мМ MES-KOH, содержащем 10 мМ MgCl2 и0.5 мМ ацетосиренгон, при плотности культуры OD600 = 0.5. Бактериальныеклетки были инфильтрованы в 4-недельные листья N. benthamiana. Растениябыли проанализированы через 48 - 96 часов после инфильтрации.2.11. Клонирование фрагментов ДНК для синтеза внеклеточныхдоменов и полноразмерных рецепторов гороха.Последовательности, кодирующие внеклеточные домены LysM-РПКSym10, Sym37 и K1, были клонированы в векторе pRSETa по сайтам BamH1и EcoR1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
