Диссертация (1144752), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Следует отметить, что все эти регуляторызадействованы в контроле развития именно инфекции при симбиозе.Эксперименты по локализации FLOT2 и FLOT4 с помощью конструкций,60представляющих репортерные слияния с GFP, показали их присутствие влипидных рафтах в мембране корневых волосков и инфекционных нитей, атакже в сформированных клубеньках M. truncatula (главным образом, в зонеинфицирования). Подавление экспрессии генов FLOT2-RNAi и FLOT4-RNAiприводило к нарушению инициации развития ИН и снижению числаформирующихсянеобходимыдляклубеньков.инициацииЭтоможетразвитияИНозначать,илиихчтофлотилиныроста.Другоепредположение связано с тем, что флотилины координируют процессыинфицирования и органогенеза (Haney and Long, 2010). Интересно отметить,что многие растительные флотилин-подобные белки были аннотированы какнодулины, поскольку они специфичным образом экспрессируются вклубеньках.Например,нодулинGmNod53экспрессируетсявперибактероидной мембране клубеньков сои, гомолог этого нодулинавыявлен в клубеньках гороха (Winzer et al., 1999; Panter et al., 2000; Saalbachet al., 2002).1.3.2.
Регуляторы выхода бактерий из инфекционных нитей и развитиясимбиосом у бобовых растений.Некоторые из компонентов сигнального каскада, активирующиеся Nodфакторами и регулирующие ранние симбиотические реакции, могут бытьтакже необходимы и для контроля более поздних процессов инфицированияклубеньков, таких как выход бактерий из инфекционных нитей иформирование симбиосом. Таким белком, играющим двойную роль присимбиозе, является LRR-РПК LjSYMRK/ MtDMI2 (рисунок 13). С однойстороны, этот компонент необходим для передачи сигнала и генерации Ca2+волн. Однако помимо этого, в уже сформированных клубеньках SYMRKэкспрессируется в зоне, где бактерии выходят из инфекционных нитей иначинается формирование симбиосом (Ivanov et al., 2010).
Подавление61экспрессии этого гена с помощью РНК-интерференции блокировало выходбактерий из инфекционных нитей и нарушало формирование симбиосом, норазвитие инфекционных нитей при этом оставалось без изменений (Capoen etal., 2005; Limpens et al., 2005; Ivanov et al., 2010). Ассоциированный смембраной растительный клубенек-специфичный белок реморин SYMREM1может контролировать локализацию SYMRK в определенной фракциимембраны (Lefebvre et al., 2010). В связи с этим подавление экспрессииSYMREM1 также влияло на эндоцитоз бактерий и процесс формированиясимбиосом.Рисунок 13. Компоненты сигнального пути у бобовых растений,вовлеченныевконтрольразвитияинфекциииформированиесимбиосом при симбиозе (Guinel, 2015).Среди транскрипционных факторов, которые активируются приформировании клубеньков и вовлечены в процесс контроля формированиясимбиосом, следует отметить HAP2 (NF-YА1) и AP2/ERF транскрипционныйфактор EFD (Combier et al., 2006; Vernie et al., 2008).
Подавление экспрессииHAP2 (NF-Y1) вызывает блокирование выхода бактерий из инфекционныхнитей (рисунок 13) (Combier et al., 2006), тогда как EFD вовлекается вконтроль и эндоцитоза и формирование симбиосом (Vernie et al., 2008). Впроцессевыходабактерийизинфекционныхнитейтранскрипционный фактор NSP1 (Heckmann et al., 2006).62участвуетиФормирование азотфиксирующих клубеньков у бобовых растенийтребует интеграции инфекционного процесса в эпидерме корня и процессовзакладки клубенькового примордия, происходящих в клетках внутреннейкоры корня, удаленных от места инфекции. Координация этих процессовявляется основным условием формирования инфицированных корневыхклубеньков.
Транскрипционный фактор CYCLOPS у L. japonicus, его гомологIPD3 у M. truncatula и SYM33 у гороха необходимы для процессаинфицирования формирующихся примордиев бактериями. Мутация в гене,кодирующемданныйбелок,приводилакнарушениюразвитияинфекционных нитей и эндоцитоза бактерий (Messinese et al., 2007; Yano etal., 2008; Voroshilova et al., 2009; Ovchinnikova et al., 2011).
Бактерии невыходили из инфекционных нитей, но если в единичных случаях такойвыход наблюдали, то бактерии оставались недифференцированными.ДальнейшиеэкспериментыфлуоресцентнойспомощьюкомплементацииLjCYCLOPS/MtIPD3/PsSYM33методапоказали,взаимодействуетсбимолекулярнойчтобелокLjCCaMK/MtDMI3/PsSYM9 и, тем самым, осуществляет взаимодействие между двумясигнальными путями, ведущими к развитию инфекции и органогенезуклубеньков (Yano et al., 2008). Более того, недавно было показано, чтокальций,кальмодулин-зависимаякиназаLjCCaMKнеобходимадляфосфорилирования транскрипционного фактора LjCYCLOPS, что приводит кего активации (Singh et al., 2014).Относительно недавно были охарактеризованы мутанты M.
truncatulaпо генам DNF1 и DNF2, у которых нарушения были связаны с процессоминфицирования и развития бактероидов (Wang et al., 2010). Бактерии умутанта dnf1 выходили из ИН посредством эндоцитоза, вокруг нихформировалась симбиосомная мембрана, однако они оставались маленькимии дальнейшего развития бактероидов не происходило. Блокированиеразвития бактероидов происходило на очень ранней стадии развития по63сравнениюсдикимтипомрастений.Приэтоманализмаркеровплазматической мембраны SNARE SYP132 (выявляется сразу после выходабактерий из ИН и поддерживается на более поздних стадиях развитиясимбиосомной мембраны), а также позднего маркера эндосомы Rab7 ивакуолярного SNARE VTI11 (появляются в мембране после прекращенияделения симбиосом и при начале старения) показал их сходство с дикимтипом.
Таким образом, не изменение идентичности мембраны являлосьпричиной остановки в развитии симбиосом у мутанта dnf1 (Wang et al., 2010).Клонирование гена показало, что DNF1 является 22 кДа белком, входящим всостав комплекса сигнальной пептидазы, наиболее раннего компонентабелкового секреторного пути в эндоплазматическом ретикулуме. Такойкомплексотщепляетсигнальныепептидыбелков, доставляемыхвовнутриклеточные компартменты или секретируемых из клетки. DNF1локализуется в инфекционной зоне клубеньков и его характер экспрессиисоответствует роли белка, участвующего в дифференцировке симбиосом.Недавние исследования показали, что у M.
truncatula в развитиисимбиосом важную роль играет транскрипционный фактор NAC074, которыйсвязывается непосредственно с промотором гена VAMP721, кодирующегобелок из семейства везикуло-ассоциированных мембранных белков (VAMPs,vesicle associated membrane proteins) (Karmarkar et al., 2014). При повышеннойэкспрессии NAC074 в клубеньках наблюдали задержку в развитиисимбиосом и сниженную нитрогеназную активность.
Авторы предположили,что NAC074 негативно влияет на развитие симбиосом, поскольку онподавляет VAMP721, участвующий в регуляции многих процессов, включаядоставку карго, что необходимо для развития симбиосом. Кроме того,недавно был охарактеризован регулятор RSD (от англ. regulator ofsymbiosome differentiation), мутант по этому гену характеризовался раннимстарением и нарушением дифференцировки бактероидов (Sinharoy et al.,2013). RSD кодирует транскрипционный фактор, в составе которого64присутствует EAR мотив (Ethylene-responsive element binding factor-associatedamphiphilic repression), что позволяет отнести его к этилен-регулируемымрепрессорам.
RSD связывается непосредственно с промотором генаVAMP721a и подавляет его экспрессию (Sinharoy et al., 2013). EARрепрессоры участвуют в подавлении синтеза защитных белков и белков,связанных со стрессом (Kazan, 2006). Следовательно, данный регуляторподавляет активацию защитных систем растения при выходе бактерий вклетки растений.Таким образом, в настоящее время у бобовых растений выявленкомплекс регуляторных белков, необходимых для инициации роста ИН,выхода бактерий из ИН и развития симбиосом (рисунок 12, 13). Анализпоказал, что активация таких ответных реакций, как деформации корневыхволосков и связанные с ними изменения цитоскелета могут не зависеть отиндукции Ca2+ - волн, в отличие от развития и роста ИН в корневых волоскахи коре корня.
Необходимы дальнейшие исследования, чтобы выяснить,являются ли выявленные регуляторы компонентами отдельных сигнальныхпутей, активируемых разными рецепторами/рецепторными комплексами присимбиозе или нет.1.3.3. Гены, вовлеченные в контроль органогенеза клубеньков бобовыхрастений.Выполненные ранее исследования позволили показать, что программаорганогенеза клубеньков может контролироваться независимо от инфекции,поскольку бактериальные мутанты exo по экзополисахаридам и бактерии,выделяющие транс-зеатин, вызывали появление у бобовых растенийклубеньков, остающихся неинфицированными (Cooper and Long 1994; Kappet al. 1990). Следовательно, программа развития клубеньков заложена всамом растении.
Анализ мутантов показал, что для органогенеза клубеньков65бобовых растений необходимо возникновение Ca2+-волн в ядрах клетокэпидермы, развивающихся после рецепции Nod-факторов. Следовательно,компоненты «общего сигнального пути», запускаемого Nod-факторами,LjSYMRK/MtDMI2/PsSYM19, LjHMGR1/MtHMGR1, LjNUP85, LjNUP133,LjNENA,LjPOLLUX/MtDMI1/PsSYM8иLjCCaMK/MtDMI3/PsSYM9непосредственно вовлечены в контроль органогенеза клубеньков присимбиозе.Белком,воспринимающимпериодическиеизменениявконцентрации Ca2+ в ядре, является кальций, кальмодулин-зависимаяпротеинкиназа CCaMK. Известно, что мутация в гене, кодирующем CCaMK,которая вызывает активацию этого белка (gain-of-function), приводит кспонтанномуклубенькообразованиюиформированию«пустых»неинфицированных клубеньков (Tirichine et al., 2006). При этом спонтанныеклубеньки имеют структурное сходство с клубеньками, формирующимисяпри симбиозе (дистально расположенная меристема, проводящие пучки), ноостаются неинфицированными.
Появление таких клубеньков соответствуетпредставлению о том, что регуляция органогенеза и инфекционного процессаосуществляется двумя разными наборами генов у бобовых растений, чтоподтверждается результатами генетического анализа (Borisov et al., 2000).CCaMK фосфорилирует транскрипционный фактор LjCYCLOPS/MtIPD3, который связывается со специфической последовательностью впромоторе гена NIN и активирует его экспрессию (Marsch et al., 2007; Singh etal., 2014). Синтез в трансгенных растениях фосфорилированной формы белкаCYCLOPSприводилкспонтанномуклубенькообразованию,чтосвидетельствует о необходимости CYCLOPS для контроля органогенеза(Singh et al., 2014).Мишенями действия NIN являются два CAAT-бокс связывающихтранскрипционных фактора NF-YA1 и NF-YB1 (Soyano et al., 2013).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
