Диссертация (1144752), страница 6
Текст из файла (страница 6)
truncatula еще один ген LYK4 может быть вовлечен в контрольинфекционного процесса при симбиозе. Мутантов по этому гену получено небыло, однако у трансгенных растений с подавлением экспрессии этого гена спомощью РНК-интерференции наблюдали нарушение развития инфекции(Limpens et al., 2003).Характеристика мутантов по генам, кодирующим LysM-РПК у M.truncatula, хорошо согласуется с ранее предложенной гипотезой об участиидвух типов рецепторов в связывании Nod-факторов у этого бобовогорастения(Ardoureletal.1994).Действительно,экспериментысбактериальными мутантами, выделяющими измененные по структуре Nodфакторы, показали, что индукция ранних реакций у M.
truncatula (изменениевнутриклеточной концентрации Ca2+, транскрипционная активация гена32нодулина MtEnod11 и начальные стадии деления клеток коры корня, ведущиек формированию примордия клубенька), требуют присутствия сульфата наостове Nod-фактора, но мало зависят от структуры жирной кислоты этоймолекулы (Ardourel et al. 1994, Oldroyd et al. 2001, Wais et al., 2000).Напротив, инфекционный процесс (формирование инфекционныхнитей) строго зависит от структурных особенностей Nod-факторов. Этопозволило предположить, что в рецепцию Nod-факторов у M. truncatulaмогутбытьвовлеченыдваразныхрецептора,различающихсяпоспецифичности и работающих на двух последовательных этапах развитиясимбиоза. Предполагается, что менее специфичный по отношению кструктуре Nod-факторов «сигнальный» рецептор контролирует развитиеранних симбиотических реакций, предшествующих инфекции, тогда какстрого специфичный по отношению к структуре Nod-факторов рецепторконтролирует процесс инфицирования ризобиями корней бобовых растений(он получил название рецептора «проникновения» от англ.
entry) (Ardourelet al. 1994).У другого бобового растения гороха P. sativum L., формирующеготакже как и Medicago клубеньки недетерминированного типа, быливыявлены два гена PsSym10 и PsSym37, кодирующие LysM-РПК, мутации покоторым приводят к нарушению развития симбиоза с ризобиями (Madsen etal., 2003; Zhukov et al., 2008). Ген PsSym10 имеет высокий уровень гомологиис геном MtNFP - 86%, сходным образом между PsSym37 и MtLyk3 уровеньгомологии составляет 85%.
У мутантов по гену sym10 отсутствовали какиелибо ответные реакции на инокуляцию ризобиями. Напротив, у горохамутация по гену sym37 специфичным образом блокировала толькоинфекционный процесс, тогда как развитие ранних симбиотических реакцийу мутанта по этому гену не нарушалось (Tsyganov et al., 2002; Zhukov et al.,2008). Более того, у гороха были выявлены две мутантных аллели генаPsSym37 – RisNod4 (sym37-1, у мутанта замена нуклеотида в гене приводит к33появлению другой аминокислоты (Leu77 → Phe) во внеклеточном домене) иК24 (sym37-2, у которого в результате замены нуклеотида появляется стопкодон в киназном домене) (Zhukov et al., 2008). Изменение аминокислоты вовнеклеточном домене у RisNod4 приводит к изменению специфичностиузнавания структуры Nod-факторов.
В частности, растения этой мутантнойлинии не формируют клубеньков со штаммом CIAM1026 (выделяет Nodфакторы без заместителя на восстанавливающем конце), но сохраняютспособность, хотя и значительно сниженную, формировать клубеньки приинокуляцииштаммомA1(выделяетNod-факторысацетиломнавосстанавливающем конце) (Zhukov et al., 2008). Кроме того, в недавноопубликованной работе по изучению полиморфизма рекомбинантныхинбредных линий гороха по их способности формировать симбиоз с nodEмутантом Rh. leguminosarum bv.
viciae, синтезирующим Nod-факторы толькос жирной кислотой С18:1 было показано, что за эту способность у горохаотвечает именно LysM-РПК SYM37 (Li et al., 2011). Эти данные позволяютпредположить, что SYM37 у гороха, также как и LYK3 у Medicago, можетбыть кандидатом на роль рецептора, который контролирует развитиеинфекции зависимым от структуры Nod-фактора образом. Однако в отличиеот M. truncatula у гороха более специфичным по отношению к структуреNod-факторов может быть не сам процесс инициации роста ИН, апродвижение ИН в клетках корневых волосков и клетках коры (Spaink et al.,1991; Walker and Downie, 2000).
Вероятно, у гороха этот рецептор правильноназвать не рецептором «проникновения», а рецептором, контролирующимрост инфекционных нитей.Такимобразом,наоснованииизучениямутантовпогенам,кодирующим LysM-РПК у бобовых растений, предполагается, что именноэти белки могут являться рецепторами к Nod-факторам у бобовых растений.Однако экспериментов по анализу связывания выявленных рецепторов слигандом, подтверждающих их биохимическую функцию как рецепторов к34Nod-факторам, проведено в настоящее время не было. Вместе с тем, анализмутантов позволяет сделать вывод о том, что рецепция Nod-факторов убобовыхрастений,формирующихклубенькидетерминированногоинедетерминированного типа, может осуществляться по-разному.
У бобовых снедетеминированнымиклубенькамирецепцияNod-факторовможетпроисходить на двух последовательных этапах развития симбиоза – напреинфекционной стадии и при развитии инфекционного процесса. Однакоэтопредположениетребуетдальнейшейпроверкиипредставлениядоказательств.1.2.4.ДополнительныеLysM-рецепторныекиназымогутбытьвовлечены в контроль ответных реакций бобовых растений на действиеNod-факторов.У растений лядвенца на ранних стадиях развития симбиоза наиболеевероятно активируется гетеродимерный рецептор, который представленбелками NFR5/ NFR1, поскольку оба мутанта по генам nfr5 и nfr1характеризуются нарушением развития симбиоза на самых ранних стадиях.
Вотличие от лядвенца, у Medicago и гороха только мутанты по генам nfp иsym10 имеют такой фенотип. Рецепторы MtNFP и PsSYM10 содержат, такжекак и LjNFR5, нефункциональные киназные домены, что указывает навзаимодействие с другим компонентом рецептора, содержащим активныйкиназный домен, который собственно и должен участвовать в передачесигнала. Этими вторыми компонентами не могут быть MtLYK3 и PsSYM37,поскольку выключение функции этих генов приводит к блокированиюразвития инфекционного процесса, а не к полному отсутствию реакции наинокуляцию ризобиями, как у мутантов nfp и sym10.Для M. truncatula были получены доказательства наличия другогокомпонента в рецепторном комплексе, взаимодействующим с NFP, в35экспериментах по анализу химерных рецепторов, содержащих внеклеточныйдомен SYM10-EX рецептора гороха P.
sativum L. и киназный домен NFP-KINM. truncatula - PsSYM10-EX – MtNFP-KIN (EX - extracellular domain, KIN kinase domain) (Bensmihen et al., 2011). Известно, что в активации раннихсимбиотических реакций у Medicago важную роль играет наличиесульфатной группы (S) на редуцирующем конце Nod-фактора, присутствиекоторой и должен различать рецепторный комплекс (Ardourel et al. 1994,Oldroyd et al. 2001, Wais et al., 2000).
Трансформация мутанта M. truncatula погену nfp химерной конструкцией pNFP::PsSYM10-EX - MtNFP-KIN приводилак активации ранних симбиотических реакций, включающих, в частности,экспрессию гена раннего нодулина MtENOD11 в ответ на инокуляцию S.meliloti или обработку очищенными Nod-факторами с сульфатной (S)группой (Bensmihen et al., 2011). Эти эксперименты свидетельствуют ополной функциональной тождественности внеклеточных доменов PsSYM10и MtNFP на ранних этапах развития симбиоза. Однако когда растения cхимернымрецепторомбылиинокулированымутантнымштаммом,выделяющим Nod-факторы без сульфата, у них не наблюдали развитиеранних симбиотических реакций и экспрессию гена нодулина MtENOD11.Это доказывает, что в узнавание сульфата вовлечен другой компонентрецептора, еще не выявленный у Medicago.
Таким компонентом не являетсярецептор LYK3, поскольку после трансформации двойного мутанта по генамnfp и lyk3 химерной конструкцией PsSYM10-EX – MtNFP-KIN в полученныхрастениях была выявлена экспрессия нодулина MtENOD11. Следовательно,не LYK3, а другой рецептор вместе с NFP вовлечен в узнаваниесульфатированных Nod-факторов у M. truncatula.При проникновении ризобийв корневые волоски (инициацииинфекционного процесса), может активироваться другой рецепторныйкомплекс, вовлеченный в связывание Nod-факторов. У Medicago и горохабелки LYK3 и SYM37 являются наиболее вероятными кандидатами на роль36такого рецептора.
Вместе с тем, исследования показали, что рецептор,вовлеченныйвконтрольразвитияинфекции,можеттакжебытьгетеромерным. Так анализ растений Medicago, у которых была подавленаэкспрессия гена NFP методом РНК-интерференции, показал их отличие отмутантов по этому гену. Если мутанты nfp характеризовались полнымподавлением работы гена и полным блоком развития симбиоза, то присохранении частичной активности белка NFP у NFP-RNAi растений ранниестадии симбиоза развивались, но развитие инфекционных нитей в корневыхволосках нарушалось (нити имели не обычную трубчатую структуру, амешкообразную структуру – от англ. «sac-like»).
Сходный фенотип такжеимели растения, у которых была подавлена экспрессия другого рецепторногогена MtLYK3. Доказательства формирования гетеромерного комплекса междубелками NFP и LYK3, необходимого для контроля развития инфекции, былиполучены недавно с помощью метода FRET-FLIM (рисунок 7) (Moling et al.,2014). Рецепторы NFP и LYK3 взаимодействовали в двух слоях клеток L1 иL2, расположенных в инвазионной зоне сразу за меристемой (рисунок 7).Рисунок 7.
Локализация LysM-РПК LYK3 (a) и NFP (в) у стабильныхтрансформантов pLYK3::LYK3-GFP и pNFP::NFP-GFP M. truncatula вклеточных слоях L1 и L2 инвазионной зоны (модифицировано Moling etal., 2014).Таким образом, у Medicago NFP контролирует активацию не толькоранних симбиотических реакций (ведущих, в частности, к активации гена37раннего нодулина MtENOD11), но также проникновение ризобий в клеткикорня посредством инфекционных нитей (Arrighi et al.,. 2006).Следовательно, наиболее вероятной моделью работы рецепторов приузнавании Nod-факторов у M. trunctula и P. sativum L., в настоящее времяможет быть модель, предполагающая вовлечение двух рецепторныхкомплексов в инициацию развития симбиоза.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
