Диссертация (1144752), страница 5
Текст из файла (страница 5)
В дальнейшем, в симбиосомах бактериидифференцируются в бактероиды (симбиотические формы), в которыхосуществляетсясинтезферментанитрогеназы,катализирующейвосстановление азота.1.2.2. Гены, контролирующие развитие бобово-ризобиального симбиоза.В последние несколько лет исследование молекулярно-генетическогоконтроля растением развития бобово-ризобиального симбиоза вышло накачественно новый уровень, благодаря развитию современных методов,позволяющих идентифицировать гены, контролирующие этот процесс.Накоплениебольшогофактическогоматериалапомолекулярно-генетическому контролю развития симбиоза стало возможным, благодаряисследованию симбиотических мутантов с нарушением отдельных стадийсимбиоза как у модельных бобовых растений - L. japonicus (Regel.) Larsen(лядвенец японский) и M.
truncatula Gaertn (люцерна слабоусеченная)(Madsen et al., 2003; Limpens et al., 2003; Radutoiu et al., 2003), так и усельскохозяйственно-значимых бобовых культур, таких как горох посевной(P. sativum L.) (Borisov et al., 2000; Tsyganov et al., 2002), соя (G. max (L.)Merr.), фасоль (Phaseolus vulgaris L.).26Исследование генетического контроля растением развития бобоворизобиального симбиоза было начато у сельскохозяйственно-значимыхкультур (горох, соя, фасоль). Однако эти растения обладают очень большимгеномом (например, геном гороха составляет около 4300 млн. п.н.), чтозатрудняет клонирование и выявление последовательности симбиотическихгенов.
В связи с этим для выявления генов, вовлеченных в контроль развитиясимбиоза, в качестве модельных видов стали использовать два бобовыхрастения L. japonicus и M. truncatula. Эти растения обладают относительнонебольшим геномом (~ 470 – 500 млн. п.н.) (Young et al., 2005; Cook, 1999),что облегчает изучение функции исследуемых генов.
В частности,генетический анализ и последующее клонирование мутантных геновпозволили значительно ускорить процесс идентификации генов, которыемогут быть вовлечены в контроль узнавания Nod-факторов и дальнейшуюпередачу сигнала к генам-мишеням. Нами был проведен анализ имеющейсяинформации по клонированным генам бобовых растений, вовлеченным вконтроль развития симбиоза.
В отдельной главе представлена информация поклонированию генов, кодирующих потенциальные рецепторы к Nodфакторам и компоненты сигнального каскада, активированного этимисигнальными молекулами. Вместе с тем, были обобщены литературныеданные по клонированию генов, контролирующих более поздние этапысимбиоза, связанные с развитием инфекции и органогенезом клубеньков.1.2.3.ПредставителисемействаLysM-рецепторныхкиназмогутконтролировать развитие симбиоза у бобовых растений.Ранее было отмечено, что наличие LysM-мотивов во внеклеточныхдоменахрецепторныхкиназможетбытьособойхарактеристикойрецепторов, необходимых для узнавания соединений, состоящих из остатковN-ацетилглюкозамина (Radutoiu et al.
2003; Madsen et al. 2003). Это27определило интерес к изучению LysM-рецепторных киназ, которые былинайдены только у растений. У модельных растений L. japonicus и M.truncatula, геномы которых были расшифрованы, семейства LysM-РПК (LYK+ LYR) включают 17 генов, которые могут быть разделены на несколькокластеров на основании экзон-интронного строения этих генов (рисунок 4а),а также анализа аминокислотных последовательностей киназного доменаэтих рецепторов (рисунок 4б, в) (Arrighi et al., 2006; Wan et al., 2008; Zhang etal., 2009; Lohmann et al., 2010).Рисунок 4а. Структура Lys генов L. japonicus (Lohmann et al., 2010).Экзоны обозначены серыми квадратами и интроны - линиями.Рисунок 4б. Филогенетическое дерево, построенное на основаниианализа аминокислотных последовательностей киназных доменов LYSбелков L. japonicus (Lohmann et al., 2010).
Три основные группыобозначены как LYS-I, LYS-II и LYS-III.28Рисунок 4в. Филогенетическое дерево, построенное на основаниианализа киназных доменов LysM-рецептор-подобных киназ M. truncatula(16), риса (6), Arabidopsis (5), и NFR1 и NFR5 L. japonicus (Arrighi et al.,2006). Выделены три группы, отмеченные как I, II и III.СредипредставителейэтихсемействнесколькоLysM-РПКнеобходимы для развития симбиоза с ризобиями у L.
japonicus и M.truncatula, что было показано на основании изучения мутантов по этим генам(Radutoiu et al. 2003, Madsen et al. 2003, Limpens et al. 2003, Arrighi et al. 2006,Mulder et al. 2006; Smit et al., 2007). Схема, суммирующая данные поизучению LysM-РПК у бобовых растений, представлена на рисунке 5.У L. japonicus были клонированы два гена LjNFR1 и LjNFR5 (Lj – L.japonicus), мутации по которым блокируют развитие практически всехответов, активируемых при инокуляции бактериями M. loti и при обработкерастений очищенными Nod-факторами этого вида ризобий (рисунок 5).Выявленные LysM-РПК относятся к двум разным типам – LYR (cизмененными киназными доменами, 1 тип) и LYK (с серин-треониновымикиназными доменами, 2 тип) (Madsen et al.
2003; Arrighi et al., 2006). Всоставе внеклеточных доменов рецепторов NFR5 и NFR1 находится по три29LysM-мотива. Одновременный перенос обоих генов LjNFR1 и LjNFR5 вдругоебобовоеM.truncatulaопределялспособностьполученныхтрансформантов вступать в симбиоз с M. loti, указывая на то, что белки NFR1и NFR5 действуют координировано, и LysM-мотивы могут отвечать заспецифическое узнавание Nod-факторов, выделяемых M. loti (Radutoiu et al.,2007). Так как у NFR5 отсутствует важный участок в киназном домене –активационная петля, в положении с 467 по 479 аминокислоту (Madsen et al.,2003), то в белке NFR5 киназный домен является неактивным (Radutoiu et al.2003). В подтверждение этого, эксперименты с меченной АТФ показали, чтотолько NFR1 белок способен к автофосфорилированию, что указывает нафункциональную активность киназного домена этого рецептора, тогда какNFR5 – нет (Radutoiu et al. 2003).
На основании анализа мутантов по этимгенам, а также строения киназных доменов белков предполагается, что NFR1и NFR5 могут быть компонентами гетеродимерного рецепторного комплексау L. japonicus, вовлеченного в связывание Nod-факторов на самых раннихэтапах симбиоза.УбобовогорастенияM.truncatula,имеющегодругойтипклубенькообразования, при анализе мутантов были также выявленынесколько необходимых для симбиоза рецепторов с LysM-мотивами вовнеклеточныхдоменах,получившихназваниеMtNFPиMtLYK3,относящиеся к двум разным типам рецепторов (рисунок 5) (Limpens et al.,2003, Arrighi et al., 2006, Mulder et al., 2006; Smit et al., 2007). Однако вотличие от L. japonicus, для которого было показано, что обе LysM-РПКнеобходимы для инициации симбиоза, у M.
truncatula выявленные белки,могут работать на разных этапах развития симбиоза. Это было выявлено наосновании анализа мутантов nfp и lyk3 M. truncatula. Анализ мутантов погену nfp (С31, T1-6, содержащие мутантные аллели nfp-1 и nfp-2) (Ben Amoret al., 2003; Arrighi et al., 2006) показал практически полное блокирование уних ответных реакций на действие Nod-факторов, также как и у мутантов30nfr5 и nfr1 L. japonicus. Однако мутации по другому гену LYK3 у Medicago(линии B56, W1, AF3, AC6, содержащие мутантные аллели hcl-1, hcl-2, hcl-3,hcl-4) вызывали специфический блок в развитии симбиоза только на стадииразвития инфекции (формирования инфекционных нитей), тогда как ранниеРисунок 5. LysM-содержащие рецептор-подобные киназы у модельныхбобовых растений и гороха.симбиотические реакции у таких мутантов не нарушались (Catoira et al.,2001; Limpens et al., 2003; Smit et al., 2007).
У мутанта B56 (hcl-1) замена вкиназном домене приводила к значительному нарушению функции белка(Smit et al., 2007). Более того, была идентифицирована слабая аллель hcl-4,которая контролирует формирование инфекционных нитей зависимым отструктуры Nod-факторов образом (Smit et al., 2007), что указывает на то, чтоLysM-РПК LYK3 может быть необходима для узнавания структурныхособенностей Nod-факторов при развитии инфекции. Действительно,эксперименты со стабильными трансформантами M.
truncatula, содержащимиконструкцию pMtLYK3::LYK3::GFP, позволили изучить более детально рольLYK3 при симбиозе. Было показано, что до инокуляции ризобиями, LYK3диффузно распределяется в мембране корневых волосков в так называемой31«чувствительной для восприятия инфекции» зоне корня (рисунок 6) (Haney etal., 2011). При инокуляции ризобиями LYK3 был локализован, главнымобразом, в формирующейся инфекционной нити. Таким образом, полученныеданныетакжеуказываютнавозможнуюрольLYK3вконтролеинфекционного процесса.Рисунок 6. Локализация рецептора LYK3 у стабильных трансформантовM. truncatula, несущих конструкцию pMtLYK3::LYK3::GFP до (А) и после(Б) инокуляции ризобиями S. meliloti (Haney et al., 2011).У M.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
