Диссертация (1144752), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Синтез осуществляли в штамме E. coli С41 (мутантный штамм,полученный на основе BL21 (DE3). Очистку белков проводили с помощьюметаллохелатной аффинной хроматографии.Полноразмерныекодирующиеклонированы в векторызатемпереклонированыпоследовательностигеновбылиpENTRY/D-TOPO и pDONR221 (Invitrogen, USA), аввектор91pB7WG2Dспомощьюметодагомологичной рекомбинации с использованием LR клоназы (Invitrogen,USA).2.12.АнализсвязывающейспособностирецепторовсNod-факторами.Связывающая способность рецепторных белков с Nod-факторами былаоценена с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса ирадиорецепторного метода. Иммобилизацию белков проводили на чипахHTG (Bio-Rad Laboratories, США).
Анализ связывания белков с лигандом NodRlv-IV, V, C18:4, Ac проводили на биосенсоре Proteon XPR36 (Bio-RadLaboratories, США).Для анализа с помощью радиорецепторного метода экстракты листьев N.benthamiana были фракционированы с помощью дифференциальногоцентрифугирования (Bono et. al., 1995). Микросомальная фракция листьевбыла инкубирована с 0,85 нM 35S-NodSm-IV (S, Ac, C16:2) в качестве лиганда втечение 1 часа при 0o C. Неспецифическое связывание было определено вприсутствиии высоких концентраций 2 мкМ «холодного» NodSm-IV (S, Ac,C16:2).2.13. Конструирование векторов для эктопической экспрессии генови РНК-интерференции.ПолноразмернаяпоследовательностьгенаPsKNOX3былаамплифицирована на матрице кДНК с соответствующими праймерами.Амплификацию фрагмента проводили с использованием Phusion Flash HighFidelity PCR смеси (Thermo Scientific, США).
Амплифицированный продуктбыл клонирован в промежуточном векторе pDONR221 с помощью BPклоназы (Invitrogen, США) и затем в векторе pB7WG2D (Университет Гента,Бельгия) с помощью LR клоназы (Invitrogen, США). После проверки92правильности полученной конструкции она была перенесена в штаммAgrobacterium rhizogenes Arqua 1.Для идентификацииIPT, LOG и KNOX генов P.
sativum L. былпроведен BLASTN поиск в недавно созданных транскриптомных базах TranscriptomeShotgunAssembly(TSA)противполноразмерныхсоответствующих кДНК M. truncatula. Были проанализированы TSA корнейи клубеньков гороха линии SGE, инокулированных Rh. leguminosarum bv.viciae (Zhukov et al., 2015) и других доступных баз TSA(BioProject:PRJNA66035 (Franssen et al., 2011), BioProject: PRJNA81209(Kaur et al., 2012), BioProject:позволилоP. sativum L.PRJNA211622 (Duarte et al., 2014) Этоидентифицироватьпоследовательностиискомыхчастичныегенов.иСоответствиеполноразмерныеполноразмерныхпоследовательностей было проверено с помощью ПЦР на кДНК (синтез былсделан на суммарной РНК, изолированной из инокулированных корнейгороха линии SGE 7 дпи) с использованием специфичных праймеров,фланкирующих кодирующие последовательности CDS (от англ.
codingsequence). Для частичных последовательностей была использована процедураRACE (rapid amplification of cDNA ends), что позволило выявить полныепоследовательности изучаемых генов.Для получения генетических конструкций для подавления экспрессииPsKNOX3, был амплифицирован фрагмент гена с 1 по 151 п.о. на матрицекДНК с помощью специфичных праймеров (при этом в последовательностьпрямого праймера была введена последовательность CACC) и клонирован вpENTR-D-TOPO векторе (Invitrogen, США), а затем в векторе pK7GWIWG2D(VIB, Гент, Бельгия) с помощью LR клоназы.2.14. Трансформация растений с помощью Agrobacterium rhizogenes.Для трансформации гороха стерилизованные семена проращивали втечение 5 дней на 1% водном агаре в темноте. 4 -5-дневные проростки93переносили в стерильные пластиковые коробки на свет и инкубировали втечение 2-3 дней. Проростки гороха обрезали в области гипокотиля итрансформировали свежей культурой A.
rhizogenes Arqua 1. Растения былипомещены в пластиковые сосуды на среду Jensen (van Brussel et al., 1982),место разреза было покрыто ватой и фольгой. Проростки культивировали с A.rhizogenes в течение 10 - 12 дней при 21 °C (16/8 ч свет/темнота), а затемперенесены на среду Emergence (Limpens et al., 2004), содержащую 150 мг/млантибиотика цефотаксима. После инкубации на среде с антибиотиком втечение 5 дней, растения были перенесены на свежую среди без антибиотикаи инкубированы еще 2 – 3 дня до появления новых корней (потенциально этикорнибылианализировалико-трансформированыподT-ДНК).эпифлюоресцентнымПоявляющиесястереомикроскопомкорни(StereoDiscovery V8, Carl Zeiss, Германия).
Растения с трансгенными корнями былиперенесены в вермикулит и находились под пленкой в течение несколькихдней. После инокуляции Rh. leguminosarum bv. viciae CIAM1026 (OD600 = 0.1- 0.2) у растений проверяли наличие клубеньков на 14 - 21 дпи.2.15. Анализ активности репортерного белка бета-глюкуронидазы втрансгенных тканях растений.Активность бета-глюкуронидазы (GUS) трансформированных корнейгороха была проанализирована при использовании 2 мM 5-бромо-4-хлоро-3индолил-β-d-глюкуроновой кислоты в качестве субстрата в NT буфере (100мМ Tris HCl, 50 мМ NaCl, pH 7.5), содержащем 2 мM феррицианид (Van denEede et al., 1992). Корни были инфильтрованы под вакуумом в течение 20мин и инкубированы в буфере для GUS окрашивания при 37° C до развитиядостаточной окраски.
После окрашивания корни были помещены в фиксатор(3 % параформальдегид, 0,25 % глутаральдегид, 0,1 % Tween-20, 0,1 % TritonX-100 в 1/3 MTSB буфера) и после инфильтрации под вакуумом (–1 атм) втечение 20 мин, инкубированы в течение ночи при °4 C и затем промыты94буфером 1/3 × MTSB (50 мМ PIPES, 5 мМ MgSO4, 5 мМ EGTA). Сегментыкорней были иммобилизованы в агарозу (2%). 50 мкм срезы были сделаны намикротоме с вибрирующим лезкием (HM 650V, Carl Zeiss, Германия).Фотографии были получены на флюоресцентном микроскопе (Carl Zeiss,Германия), содержащем цифровую камеру MRc5 (Carl Zeiss, Германия) спомощью программы ZEN 2011 (Carl Zeiss, Германия).2.16.
Выделение и анализ цитокининов.Для выделения цитокининов за основу был взят метод Dobrev и Kaminek(Dobrev and Kaminek, 2002) с использованием колонок Oasis MCX (Waters),представляющихкатионообменника.собойсорбентАнализсосвойствамицитокининовобратнойпроводилиcфазыипомощьюультрапроизводительной жидкостной хроматографии на колонках AcquityUPLC BEH RP18 (Waters, USA) с последующим масс-спектрометрическиманализом (тандемный квадрупольный масс-спектрометр проточного типаWaters XEVO TQ с положительной электроспрей-ионизацией образца (ESI+)).2.17. Статистические методы и компьютерные программы.Сравнение нуклеотидных последовательностей проводили с помощьюалгоритма Clustal W (Thompson et al., 1994) программы Vector NTI Advance10 (InforMax, Inc http://www.informaxinc.com).
Программа MEGA 6 былаиспользована для построения филогенетических деревьев. Статистическаяпрограмма One-way ANOVA была использована для сравнения уровняэкспрессии генов в корнях трансгенных растений гороха.95Глава 3. Результаты и обсуждениеЧасть 1. Изучение сигнального обмена между горохом P. sativum L.
иклубеньковыми бактериями на начальных этапах развития симбиоза.Симбионты гороха ризобии Rh. leguminosarum bv. viciae выделяютсостоящие из 4-5 мономерных остатков Nod-факторы, содержащие ацетил наневосстанавливающем конце и жирную кислоту C18:4 и C18:1 - NodRlv - IV,V,Ac, C18:4, C18:1. Выполненные ранее исследования по изучению влияния нагорох мутантных штаммов ризобий Rh. leguminosarum bv. viciae nodL,nodFEL-, nodO-, выделяющих измененные по структуре Nod-факторы(NodRlv - IV,V, C18:1), показали, что активация ранних симбиотическихреакций (таких как, деформации корневых волосков, осцилляции Са2+) уэтого бобового растения не зависит строго от структурных особенностейNod-факторов. Напротив, рост инфекционных нитей и внутриклеточноераспространение инфекции, а также формирование примордиев клубеньков –специфично по отношению к структуре заместителей на этих молекулах(наличию ацетила и жирной кислоты C18:4 на невосстанавливающем концеNod-фактора) (Spaink et al., 1991; Walker and Downie, 2000).
Сходная картинанаблюдается у модельного растения люцерны слабоусеченной M. truncatula,также как и горох формирующего клубеньки недетерминированного типа.Эти представления нашли отражение в теории, согласно которой у люцерны,формирующей клубеньки недетерминированного типа, в связывание Nodфакторов могут быть вовлечены два типа рецепторов – «сигнальный»рецептор (от англ. signaling receptor), который работает на самых раннихэтапах симбиоза, и рецептор «проникновения» (от англ.
entry receptor),контролирующий развитие инфекции (Ardourel et al., 1994).На основании анализа влияния на горох мутантных штаммов ризобий,можно предположить, что в связывание Nod-факторов у этого вида бобовыхрастений также вовлечены два разных по специфичности рецептора.96Действительно, выявление у гороха двух LysM-РПК Sym10 и Sym37, а такжеданные о блокировании у мутантов по этим генам различных процессов приразвитии симбиоза (начальных этапов развития симбиоза и инфекционногопроцесса), указывали на возможность участия в контроле развития симбиозадвух типов рецепторов. При этом наличие у Sym10 «нефункционального»киназного домена (Madsen et al., 2003) предполагает возможностьвзаимодействиясоответствуеткомплексас«дополнительной»представлению(сигнальногоорецепторнойработерецепторногокиназой.олигомерногокомплекса),аЭторецепторногонеотдельнойрецепторной киназы.
Действительно, анализ существующих в литературеданных о работе мембранных рецепторов позволяет сделать вывод о том, чтоактивационный механизм работы таких рецепторов связан с формированиемгомо- или гетероолигомерных комплексов белков, что приводит к активациикиназных доменов и распространению сигнала (Antolín-Llovera et al., 2012;Miyata et al., 2014; Cao et al., 2015).Такой дополнительной рецепторной киназой в комплексе с Sym10маловероятно может быть Sym37. Изучение мутантов по гену sym37 ясноуказывает на то, что ранние этапы развития симбиоза у них не блокируются,как у мутантов по гену sym10, что делает маловероятной возможностьучастия рецептор-подобной киназы Sym37 в инициации развития симбиоза(Madsen et al., 2003; Zhukov et L., 2008).
С рецептором Sym37 может бытьсвязана способность растений гороха различать структурные изменения влиганде (то есть проявлять специфичность по отношению к структуре Nodфакторов), что делает его возможным кандидатом на роль «рецепторапроникновения» (Li et al., 2011).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
