Диссертация (1144752), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Работает ли при этом рецептор Sym37 в видегомоолигомера или образует комплекс с другой рецепторной киназой(формирует гетероолигомер) также остается неизвестным. Выполненныеранее генетические исследования показали, что белок, кодируемый геномSym2, определяет способность растений гороха различать разные по97структуре Nod-факторы и контролирует развитие инфекции (Geurts et al.,1997). Следовательно, в состав рецепторного комплекса, контролирующегоразвитие инфекции, может также входить несколько белков. Это означает,что у гороха, вероятнее всего, два олигомерных рецепторных комплексаконтролируют развитие начальных стадий и инфекционный процесс присимбиозе.Однако экспериментальных данных (кроме характеристики двухмутантовпогенамLysM-рецепторов),которыеподтверждалибывозможность последовательной активации у гороха двух рецепторныхкомплексов при связывании Nod-факторов, до настоящего времени полученоне было. Кроме того, поиск «дополнительных» новых рецепторов, которыеработают на ранних этапах развития симбиоза в составе комплекса с Sym10,а также в комплексе с Sym37 при развитии инфекции представляетзначительный интерес.
В связи с этим, на первом этапе нашей работынеобходимобылополучитьдоказательстваактивацииразныхрецепторов/рецепторных комплексов и путей передачи сигнала при развитиисимбиоза. С этой целью мы попытались найти маркеры, активация которыхбыла бы связана с индукцией разных сигнальных путей при связывании Nodфакторов. Вместе с тем, актуальной задачей являлся поиск и характеристикау гороха ранее не известных рецепторных киназ, контролирующих рецепциюNod-фактороввкомплексесужеизвестными«потенциальнымирецепторами» - рецептор-подобными киназами Sym10 и Sym37.
Наконец,необходимо было показать, что известные LysM-РПК Sym10 и Sym37обладаютспособностьюсвязыватьNod-факторы,тоестьизучитьбиохимическую функцию этих рецепторов.Основными задачами данного раздела являлись:1.Поиск молекулярных маркеров, экспрессия которых могла быть связанас активацией разных сигнальных путей у гороха при рецепции Nod-факторов.982.Изучение биохимической функции рецепторов Sym10 и Sym37 у гороха.3.Выявление новых кандидатов на роль рецепторов к Nod-факторам угороха и оценка их способности контролировать развитие симбиоза.1.1. Поиск молекулярных маркеров, экспрессия которых могла бытьсвязана с активацией разных сигнальных путей у гороха при рецепцииNod-факторов.У бобовых растений рецепция Nod-факторов и активация каскадасигнальной трансдукции запускает экспрессию генов, которые специфичнымобразом активируются при симбиозе, генов ранних нодулинов Enod (от англ.E – early, NOD - nodulin).
Экспрессия многих из этих генов имеет отношениек определенным этапам развития симбиоза. Например, гены нодулиновмалого семейства, включающего MtEnod16 (M. truncatula), VsEnod5 (Viciasativa), GmEnod55/N135, кодирующие ассоциированные с мембранамиарабиногалактан-подобные белки, преимущественно экспрессируются вклетках коры клубенька, в которые проникли инфекционные нити и в зонезаражения в сформированных клубеньках (зона II) (Vijn et al., 1995; Green etal., 1998; Vernoud et al., 1999). Другой нодулин MtEnod20 является маркеромкортикального клеточного деления при формировании клубеньков (Vernoudet al., 1999).
Наконец, нодулин MtN6 экспрессируется только в клеткахформирующегося примордия клубенька, в которые проникли инфекционныенити (Mathis et al., 1999). Такая специфичность и избирательностьпредполагает возможность использования экспрессии нодулинов в качествемаркеров для анализа определенных стадий развития симбиоза.У гороха был проведен анализ экспрессии нескольких генов нодулинов,среди которых PsEnod5 и PsEnod12a (Scheres et al., 1990a, б). Экспериментыпо in situ гибридизации показали, что PsEnod5, экспрессируется в клеткахкорня, в которые проникли инфекционные нити, в то время как PsEnod12a,99кодирующий пролин-богатый белок, экспрессируется первоначально внеинфицированных клетках примордия клубенька (дистанционно, посколькуNod-факторы остаются связанными с клетками эпидермиса), а позднее винфицированных и неинфицированных клетках клубенька (Scheres et al.,1990a, б; Greene et al., 1998).
Это показывает, что экспрессия двух геновнодулинов PsEnod5 и PsEnod12a регулируется по-разному при симбиозе.Следовательно, в активацию экспрессии гена PsEnod5 могут быть вовлеченыдругие регуляторные компоненты сигнального пути. Для проверки этогопредположения мы проанализировали экспрессию двух нодулинов у рядамутантов гороха по генам, контролирующим передачу сигнала от Nodфакторов, а также у мутантов по генам, кодирующим рецепторы Sym10 иSym37.1.1.1.
Анализ экспрессии генов ранних нодулинов PsEnod5 и PsEnod12a усимбиотических мутантов гороха.Генетический анализ симбиотических мутантов и последующееклонирование генов у гороха и модельных бобовых растений (M. truncatula иL. japonicus) привели к идентификации компонентов, вовлеченных всигнальный каскад, активируемый Nod-факторами. Наряду с LysMрецепторами, кодируемыми генами PsSym10 и PsSym37, были выявленынесколько белков, которые необходимы для передачи сигнала в ядро итранскрипционной активации генов-мишеней (Imaizumi-Anraku et al. 2005;Kanamori et al. 2006).
Среди них рецепторная киназа с лейцин-богатымиповторами во внеклеточном домене (PsSym19), а также локализующиеся вядерной мембране нуклеопорины и К+-зависимый катионный канал (PsSym8),которые необходимы для генерации Ca2+-волн, Ca2+/кальмодулин-зависимаяпротеинкиназа CCaMK (PsSym9), регулятор CYCLOPS (PsSym33), а такжетранскрипционный фактор NSP2 (PsSym7) и транскрипционный фактор NIN100(PsSym35), вовлеченные в транскрипционную активацию генов-мишеней(рисунок 16). Известно, что гены PsSym19, PsSym8, PsSym9 относятся к такназываемым генам «общего сигнального пути», которые необходимы дляконтроля передачи сигнала не только при симбиозе с азотфиксирующимибактериями, но и при развитии симбиоза с грибами арбускулярной микоризы(рисунок 16).
У мутантов по этим генам наблюдаются только деформациикорневых волосков в ответ на инокуляцию и изменения во внутриклеточнойконцентрации ионов Ca2+, но нет признаков развития инфекционногопроцесса и органогенеза клубеньков. Гены PsSym7 и PsSym35 контролируютпередачу сигнала от Nod-фактора после генов «общего сигнального пути»(рисунок 16). У мутантов по этим генам наблюдаются скручивания корневыхволосков, но признаков развития инфекционного процесса и формированияпримордиев клубеньков у них не выявлено.Рисунок 16. Компоненты «общего сигнального пути» (ОСП) у бобовыхрастений.Помимо этих клонированных генов у гороха были выявлены 6дополнительных регуляторных Sym генов (Sym5, Sym14, Sym16, Sym34, Sym36иSym38),которыенебылиописаныумодельныхбобовыхипоследовательности которых остаются неизвестными.
Анализ мутантов поэтим генам показал, что у них наблюдаются скручивания корневых волосков101в ответ на инокуляцию R.l.v., но нарушаются различные стадии органогенезаклубеньков и развития инфекционных нитей. Это указывает на роль этихрегуляторных генов в контроле инфекции и органогенеза. Для изученияэкспрессии нодулинов нами были использованы мутанты гороха по 12 генам(6 известным и 6 не клонированным), характеризующиеся блоком развитиясимбиоза на различных стадиях - sym5 (R88), sym7 (SGENod--6, RisNod14,E69), sym9 (R72), sym10 (P56), sym14 (E135N), sym16 (R50), sym19 (RisNod2),sym34 (RisNod23), sym35 (SGENod- -3), sym36 (RisNod26), sym37 (RisNod4,K24) и sym38 (SGENod- -8) (рисунок 16).У растений гороха дикого типа значительное увеличение уровняэкспрессии генов PsEnod5 и PsEnod12a было выявлено через 24 – 48 часовпосле инокуляции бактериями Rh.
leguminosarum bv. viciae или обработкиNod-факторами в зоне корня, восприимчивой к заражению бактериями идействию Nod-факторов (Albrecht et al., 1998). В связи с этим мыпроанализировали экспрессию генов нодулинов в такой «восприимчивой»зоне через двое суток (48 часов) после инокуляции.Рисунок 17а. Анализ экспрессии генов PsEnod12a и PsEnod5 в корняхгороха дикого типа после инокуляции Rh.
leguminosarum bv. viciae (R.l.v.).Уровень транскрипции генов был проанализирован методом ОТ-ПЦР в корнях гороха P.sativum, обработанных водой или инокулированных R.l.v. CIAM1026. ПЦР продукты былисобраны после 16, 18, 20, 22, 24 и 26 циклов амплификации. Экспрессия убиквитина (Ub)была использована для стандартизации количеств кДНК между образцами.
ПродуктыПЦР были гибридизованы с ДНК пробами - 32P-PsEnod5, PsEnod12a и убиквитином послещелочного переноса на мембрану Hybond-N+.102Так как симбиотические мутанты были получены на четырех различныхгенетических сортах и линиях гороха (сорт Sparkle, сорт Finale, линия SGE илиния Frisson), нами первоначально было проведено сравнение уровняэкспрессии генов PsEnod5 и PsEnod12a у растений дикого типа. Уровеньэкспрессии этих генов в корнях всех сортов и линий гороха дикого типа(Sparkle, Frisson, SGE, Finale) после инокуляции ризобиями был одинакововысоким, тогда как в не инокулированных корнях он оставался на уровнефона (рисунок 17а).На следующем этапе экспрессия генов PsEnod5 и PsEnod12a в ответ наинокуляцию ризобиями была изучена у 14 мутантов гороха, блокированныхна различных этапах развития симбиоза (рисунок 17б и 18).
Было показано,что экспрессия двух генов по-разному проявлялась у мутантов. В то времякак фоновый уровень экспрессии PsEnod5 и PsEnod12a был выявлен вкорнях всех не инокулированных растений мутантов, в ответ на инокуляциюR.l.v. экспрессия PsEnod5 и PsEnod12a не увеличивалась в растениях,мутантных по генам sym10 (P56), sym19 (RisNod2), sym9 (R72) и sym7(мутантные линии RisNod14 и SGENod--6) а (рисунок 17б и 18). ЭспрессииPsEnod5 и PsEnod12a также не наблюдалось у мутанта по гену sym8 (R25)(Albrecht et al., 1998). Согласно фенотипической характеристике мутантовэти Sym гены контролируют наиболее ранние этапы передачи сигнала послерецепции Nod-факторов и абсолютно необходимы для индукции всехсимбиоз-специфичных генов. У всех других мутантов гороха, была выявленаэкспрессия PsEnod12a независимо от того, на каком этапе органогенезаклубеньков или развития инфекционного процесса наблюдались у нихнарушения симбиоза (рисунок 18).103Рисунок 17б.
Профили экспрессии генов PsEnod12a, PsEnod5 иубиквитинавкорняхсимбиотическихмутантовгороха,инокулированных R.l.v. CIAM 1026. ПЦР продукты были собраны после 26циклов амплификации и разделены в 1.5% агарозном геле. Экспрессия убиквитина (Ub)была использована для стандартизации количеств кДНК между образцами. ПродуктыПЦР были гибридизованы с ДНК пробами - 32P-PsEnod5, PsEnod12a и убиквитином послещелочного переноса на мембрану Hybond-N+.Рисунок 18.
Анализ экспрессии PsEnod12a, PsEnod5 и убиквитина вкорнях симбиотических мутантов и гороха дикого типа сорта Finale,сорта Sparkle и сорта Frisson в ответ на инокуляцию R.l.v. CIAM 1026.ПЦР продукты были собраны после 26 циклов амплификации и разделены в 1.5%агарозном геле. Экспрессия убиквитина (Ub) была использована для стандартизацииколичеств кДНК между образцами.Таким образом, было показано, что индукция экспрессии генаPsEnod12a зависит только от компонентов «общего» сигнального пути,которые вовлечены в передачу сигнала от Nod-факторов (или Myc-факторов),и может рассматриваться как маркер активации ранних симбиотических104событий,предшествующихформированиюклубеньковиразвитиюинфекции.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
