Диссертация (1144752), страница 33
Текст из файла (страница 33)
Эти рецепторы были идентифицированы у рядабобовых растений (люцерны слабоусеченной, лядвенца, гороха и сои) 212MtSUNN/LjHAR1/PsSYM29/GmNARK(CLAVATA1),LjCLV2/PsSYM28(CLAVATA2) и LjKLV (KLAVIER) (Krusell et al., 2002; Searle et al., 2003;Schnabel et al., 2005; Krusell et al., 2011). У арабидопсиса все гомологичныерецепторы CLV1, CLV2, RPK2/TOAD2 формируют различные гомо- игетероолигомерныекомплексыинеобходимыдляузнаванияCLV3регуляторного пептида, что активирует сигнальный путь, необходимый дляподдержания популяции стволовых клеток в ПАМ (Oka-Kira and Kawaguchi,2006; Bleckmann et al., 2010; Guo et al., 2010; Kinoshita et al., 2010; Miyazawaet al., 2010). Это позволяет предположить, что сигналом, узнаваемымсистемой рецепторов CLV и KLV у бобовых растений, могут также являтьсярегуляторные пептиды.У бобовых растений мутации в генах, кодирующих CLV1-подобный иCLV2 рецепторы, а также KLV, приводят к суперклубенькообразующемуфенотипу.Экспериментысуперклубенькообразующийспрививкамифенотиптакихпоказали,мутантовчтоопределяетсяпобеговой частью растения (Miyazawa et al., 2010; Okamoto et al., 2013).Таким образом, CLV1-подобный и СLV2 рецепторы, а такжеKLVфункционируют в побеге.
В общем виде процесс авторегуляции сводится кобмену сигналами, которые действуют на расстоянии, то есть удаленно отместа синтеза. Инокуляция растений ризобиями приводит к выработкесигнала в корне (RS, от англ. root signal), который поступает в побег,воспринимаетсятамузнающимисистемами,чтовсвоюочередь,способствует активации другого сигнала в побеге (SDI, от англ. shoot derivedinhibitor), который поступает в корни и ингибирует дальнейшую закладкуклубеньков (Oka-Kira and Kawaguchi, 2006; Sasaki et al., 2014).
Какова жеприрода сигналов, выделяемых в корне (RS) и побеге (SDI)? Cигнальнымимолекулами, вырабатываемыми в корне (RS) и запускающими системуавторегуляции,могутявлятьсяCLE-пептиды(CLAVATA3/EMBRYO-SURROUNDING REGION (CLE)). У модельных бобовых растений (M.213truncatula, L. japonicus) были выявлены гены MtCLE13, LjCLE-RS1,LjCLERS2, кодирующие CLE-пептиды, экспрессия которых специфичноактивируется при клубенькообразовании (Okamoto et al. 2009, Mortier et al.2010).
Вероятно, специфичные для клубеньковCLE-пептиды могутвзаимодействовать с системой рецепторов в побеге. При этом остаетсянеясным: перемещаются ли CLE-пептиды сами в побег, где связываются срегуляторными рецепторами или взаимодействуют с системой рецепторов,работающими в корне, что способствует выработке дополнительногосигнала, который перемещается в побег и там взаимодействует срецепторами CLV и KLV.Вместе с тем, у бобовых растений были выявлены мутанты rdn1, tml,plenty, суперклубенькообразующий фенотип которых определяется корневойчастью растения (Schnabel et al., 2011; Novak et al., 2010, 2011; Magori et al.,2009; Yoshida et al., 2010; Takahara et al., 2013).
У мутанта rdn1 M. truncatula(его гомологом у гороха является ген PsNOD3) нарушения связаны с белком,который может быть необходим для транспортировки сигнала междукорнями и побегами (Schnabel et al., 2011; Novak et al., 2010, 2011). Мутация вдругом гене tml у L.
japonicus вызывает нарушения в F-бокс-содержащемтранскрипционном факторе (Magori et al., 2009; Takahara et al., 2013), а ген,имеющий нарушения у мутанта plenty, еще не идентифицирован (Yoshida etal., 2010). Несмотря на то, что природа самого SDI сигнала остаетсянеизвестной, наиболее вероятно оба компонента, дефектные у мутантов tmlи plenty, работают на стадии передачи/ восприятия SDI сигнала уже отактивированных рецепторов CLV1, CLV2 и KLV (Takahara et al., 2013).Наличие мутантов с нарушениями в работе как побеговой, так и корневойсистем авторегуляции позволяет использовать их в качестве удобныхмоделей для изучения взаимодействия компонентов этой системы у бобовыхрастений.214Практически неизученными остаются процессы, которые активируютсяSDI сигналом при авторегуляции.
Однако сходство с CLV3 сигнальнымпутем может указывать на то, что и мишени действия CLV системы могутбыть похожими. В ПАМ взаимодействие между CLV3 и гомеодоменсодержащим транскрипционным фактором WUSCHEL (WUS) необходимодля поддержания пула стволовых клеток (Schoof et al., 2000). WUS работает ворганизующем центре ПАМ и необходим для поддержания пролиферациистволовых клеток (Mayer et al., 1998; Schoof et al., 2000).
При этомвзаимодействие между пептидом CLV3 и CLV1, CLV2 рецептораминегативно регулирует экспрессию WUS, тем самым ограничивая размерпопуляции стволовых клеток в ПАМ (Brand et al., 2000; Schoof et al., 2000). Вапикальной меристеме корня (КАМ) функционирует сходная сигнальнаясистема, в которую входит WUSCHEL-RELATED HOMEOBOX5 (WOX5),который синтезируется в покоящемся центре корня и регулирует балансмежду пролиферацией и дифференцировкой клеток (Kamiya et al., 2003;Haecker et al., 2004). WUS и WOX5 функционально эквивалентны и могутбыть вовлечены в сходные регуляторные пути, которые необходимы дляподдержания активности и развития меристем (Sarkar et al., 2007).
Вчастности, в КАМ регуляторный пептид CLE40, а также рецепторная киназаARABIDOPSIS CRINKLY4 (ACR4) могут влиять на экспрессию гена WOX(StahlandSimon,клубенькообразования2009).уРанеегорохамыможетпоказали,чтозначительновпроцессеувеличиватьсяэкспрессия гена WOX5, представителя семейства WOX генов (часть 4 главы«Результаты и обсуждение»).
Необходимо было выяснить, может липредставитель семейства WOX генов (ген WOX5) являться мишенью действиясистемы комплексов CLV и KLV при авторегуляции клубенькообразования.В авторегуляцию могут быть вовлечены и гормоны. В частности,цитокинины регулируют экспрессию MtCLE13 у M. truncatula (Mortier et al.,2010). Более того, введение спонтанно активированного рецептора к215цитокинину LjLHK1 в мутант har1 (нарушения в CLV1-подобном рецепторе)приводит к развитию большого числа спонтанных клубеньков (Takahara etal., 2013). Это указывает на то, что компоненты AON влияют на развитиеклубеньков через подавление работы цитокининового рецептора LjLHK1(Wopereis et al., 2000; Tirichine et al., 2007; Miyazawa et al., 2010).
Былопоказано, что экспрессия генов CLE индуцируется в ответ на инокуляцию(Okamoto et al., 2009; Mortier et al., 2010). Однако такая активацияотсутствует у мутантов по генам cre1 у M. truncatula, что указывает на то, чтоCLE-пептиды действуют на этапе после активации рецептора к цитокининуCRE1 (Mortier et al., 2012). При этом остается неизвестным, как зависитактивация генов, кодирующих CLE-пептиды, от других компонентовсигнального каскада, активируемого Nod-факторами.Для нас представляло интерес выяснить роль CLE-регуляторныхпептидов в контроле органогенеза клубеньков у гороха, а также механизмывзаимодействия этих пептидов с другими регуляторными компонентамисистемы авторегуляции– рецепторами CLV и возможными мишенямидействия этих регуляторных комплексов, контролирующими численностьклубеньков при симбиозе.Задачами данного раздела исследований являлись:1.Идентификация CLE-пептидов у гороха, вовлеченных в системуавторегуляции симбиоза.2.Выявление стадии передачи сигнала от Nod-факторов, на которойактивируется CLE-пептид у гороха в процессе развития симбиоза.3.АнализклубеньковвлиянияусверхэкспрессиитрансгенныхрастенийCLE-пептидовгороханадикогоразвитиетипаисуперклубенькообразующих мутантов.4.Изучение взаимодействия гена WOX5 и компонентов системыCLAVATA при развитии клубеньков у гороха.2165.1.ИзучениеролиCLE-регуляторныхпептидоввконтролеорганогенеза клубеньков у гороха.5.1.1 Идентификация CLE-пептидов у гороха, вовлеченных в системуавторегуляции симбиоза.В геноме M.
truncatula ранее было идентифицировано 25 генов,кодирующих CLE-пептиды (Cock and McCormick, 2001; Oelkers et al., 2008;Mortier et al., 2010), среди которых повышенный уровень экспрессии приклубенькообразовании был выявлен для двух генов MtCLE12 и MtCLE13,кодирующих CLE-пептиды (Mortier et al., 2010).
В геноме другогомодельного растения Lotus было идентифицировано 39 генов, кодирующихCLE-пептиды,срединихповышенныйуровеньэкспрессиивинокулированных корнях был выявлен для трех генов – LjCLE-RS1, LjCLERS2 и LjCLE3 (Okamoto et al., 2009; Magori and Kawaguchi, 2010).Комплексный анализ показал, что в контроле авторегуляции симбиозаосновную роль играет MtCLE13-пептид у M. truncatula, а также LjCLE-RS1,LjCLE-RS2-пептиды у L. japonicus.Для поиска гомологичных генов у гороха нами были сконструированывырожденные праймеры, что позволило сначала амплифицировать фрагментгена,азатемспомощьюполноразмерныйгенPsCLE,СравнительныйанализвыявилпроцедурыRACEкодирующийвысокийидентифицироватьCLE-пептидуровеньгомологиигороха.междупоследовательностями гена PsCLE гороха, гена люцерны MtCLE13 и генамилядвенца LjCLE-RS1, LjCLE-RS2 (рисунок 70).
При этом наиболее высокийуровень гомологии был выявлен в области CLE-мотива пептидов. Такимобразом, нами была определена у гороха последовательность CLE-пептида,217специфичного для клубеньков. По аналогии с геном M. truncatula этот генполучил название PsCLE13.Рисунок 70. Сравнительный анализ последовательности специфичногодляклубеньковCLE-пептидапоследовательностямигорохаCLE-пептидаслюцернысоответствующимиMtCLE13иCLE-пептидами лядвенца LjCLE-RS1 и LjCLE-RS2.5.1.2. Анализ экспрессии PsCLE13 гена у растений дикого типа имутантов sym9 (CCaMK), sym33 (IPD3/CYCLOPS), sym7 (NSP2), sym35(NIN), кодирующих компоненты сигнального пути, активируемого Nodфакторами у гороха.При анализе уровня экспрессии гена PsCLE13 в процессе развитиясимбиоза было выявлено его значительное увеличение, начиная с 3 дня послеинокуляции (рисунок 71 a).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
