Диссертация (1144752), страница 36
Текст из файла (страница 36)
Вместе с тем, анализ растений с подавлениемэкспрессии гена PsLyk9 показал их повышенную чувствительность кзаражению слабопатогенным штаммом гриба Fusarium culmorum (Wm.G.Sm.)Sacc.891.Снижениеустойчивостикзаражениюкоррелировалоспониженным уровнем экспрессии генов, кодирующих защитные белки иферменты (PsPR10, PsPR1, PsPAL2).
Полученные результаты позволяютсделать вывод о том, что Lyk9 является бифункциональным рецептором,который контролирует формирование АМ симбиоза и развитие устойчивостик фитопатогенам. Изучение принципов работы такого рецептора станет вдальнейшем основой для понимания того, как у растений формируется232симбиозили,напротив,индуцируетсясистемаустойчивости,препятствующая развитию внутриклеточной инфекции.Выполненные нами исследования показали, что у гороха при развитиисимбиоза происходят существенные изменения в содержании гормоновцитокининов и ауксинов. Эти изменения связаны как с начальными этапамиформирования клубеньков, так и с последующими более поздними этапами развитием инфекционного процесса и дифференцировкой клубенька.Действительно, анализ динамики экспрессии генов, кодирующих регуляторыцитокининового ответа RR А-типа (PsRR4, PsRR5, PsRR8, PsRR9 и PsRR11),показал, что активация рецептора к цитокининам у гороха можетпроисходитьна нескольких этапах при развитии симбиотическихклубеньков.
В ответ на инокуляцию гороха ризобиями происходит активациярецептора к цитокининам еще до закладки примордиев клубеньков, а вформирующихся клубеньках вновь возрастает уровень экспрессии геновмаркеров цитокининового ответа, что свидетельствует о дополнительнойстимуляции рецептора. Эти изменения коррелировали с увеличениемсодержания транс-зеатина и изопентениладенина на ранних сроках послеинокуляции (1 – 3 дпи), а также в формирующихся клубеньках гороха (7 – 10дпи).Было установлено, что у растений гороха в ответ на инокуляцию наранних стадиях развития симбиоза (1 – 3 дпи) происходят измененияэкспрессии генов, кодирующих переносчики ауксинов PIN, что можетприводить кнарушению полярноготранспорта ауксинов(ПАТ)иперенаправлению потока ауксинов в клетки формирующегося примордия.Активация ауксин-регулируемой репортерной конструкции pDR5:GUS-NLS вразвивающихся примордиях клубеньков гороха свидетельствует о локальномнакоплении ауксинов.
Следовательно, появлению клубеньков предшествуетсоздание «максимумов концентрации» ауксинов в клетках, из которых вдальнейшем развиваются примордии этих органов у бобовых растений.233Создание таких «максимумов» зависит от Nod-факторов и активациицитокининового ответа в растениях и контролируется за счет транспортаауксинов. Влияние цитокининов на белки-транспортеры ауксинов PIN итранспорт ауксинов при формировании клубеньков имеет много общего сучастием цитокининов в контроле программы развития боковых корней, чтоможет свидетельствовать об эволюционном родстве двух морфогенетическихпрограмм.Анализ мутантов с нарушением способности формировать клубеньки(Nod- фенотип) показал, что стимуляция рецептора к цитокининам зависит отбиосинтеза этих гормонов в самом растении за счет ферментов IPT и LOG.Мы показали, что отсутствие способности формировать клубеньки у Nodмутантов гороха коррелирует с отсутствием активации ряда генов биосинтезацитокининов IPT и LOG, что подтверждает важность именно синтезацитокининов в растениях для активации рецептора к этим гормонам иформирования клубеньков.Важным вопросом являлось выяснение роли цитокининов на болеепоздних этапах развития клубеньков.
Нам удалось показать, что увеличениесодержания цитокининов в уже сформированных клубеньках зависит отинфекционного процесса. У мутантов гороха с нарушением процесса выходабактерий из инфекционных нитей в ткани клубенька, отсутствовалаактивация генов PsIPT3 и PsLOG1, 2, 4 и 5. Возможной функциейцитокининов на более поздних стадиях развития симбиоза может быть ихучастие в контроле процессов эндоредупликации и дифференцировкиклубенька, поскольку недавно выполненные исследования на модельномрастении арабидопсисе показали участие цитокининов в контроле этихпроцессов в корнях (Takanashi et al., 2013). Другой возможной причинойнакопления цитокининов уже в формирующихся клубеньках может быть ихучастие в подавлении защитных систем растения, что способствуетпроникновениюризобийвнутрь234клетокрастенияиразвитиювнутриклеточной инфекции. В пользу этого предположения свидетельствуютданные по изучению мутанта бобовых растений по рецептору у цитокининамcre1, который оказался более устойчивым к заражению фитопатогенами.Анализ динамики экспрессии генов KNOX3 и WOX5, а такжелокальный анализ экспрессии этих генов в трансгенных растениях,содержащих репортерные конструкции, показал непосредственное участиедвух транскрипционных регуляторов в процессе развития симбиотическихклубеньков у гороха.
Ранее роль ТФ KNOX и WOX семейств была изучена,главным образом, для апикальных меристем растений – ПАМ и КАМ.Выполненные нами эксперименты позволили показать участие в регуляцииразвития примордия/меристемы клубенька ТФ KNOX и WOX семейств, чтопредполагает наличие сходных механизмов контроля развития разных типовмеристем у растений с участием «общих» регуляторов.Анализ сиспользованием репортерных конструкций показал, что экспрессия двухгенов связана с активно пролиферирующими клетками как примордиевбоковых корней, так и клубеньков, что свидетельствует об участии ТФ вконтроле двух программ органогенеза.
При инокуляции растений ризобиямиэкспрессия генов KNOX3 и WOX5 увеличивалась и была главным образомсвязана с клетками формирующихся примордиев клубеньков. Таким образом,одни и те же гены могут контролировать начальные этапы развития боковыхкорней и клубеньков у гороха.У бобовых растений с недетерминированным типом клубеньковпрограмма развития клубеньков имеет много общего с программойформирования боковых корней на начальных этапах, поскольку оба этихоргана образуются в результате реактивации делений клеток перицикла иэндодермы.
Это позволило предложить некоторым авторам гипотезу о том,что программа развития клубеньков эволюционировала на основе программыразвития боковых корней. В пользу этого предположения свидетельствуютданные о том, что Nod-факторы могут стимулировать развитие не только235клубеньков, но и боковых корней (Gonzales-Rizo et al., 2006; Maillet et al.,2011). Кроме того, стимуляция развития боковых корней Nod-факторамизависит от основных генов, контролирующих передачу сигнала послерецепции Nod-факторов.На фоне сверхэкспрессии ТФ KNOX3 у растений гороха могутобразовыватьсяклубенько-подобныеструктуры,которыебольшенапоминают видоизмененные корни (с центральным проводящим пучком).При этом подавление экспрессии KNOX3 с помощью РНК-интерференции невлияло на сам процесс закладки клубеньков, что может быть связано сучастием ТФ KNOX3 в контроле более поздних стадий развития этихорганов.
Такие данные, на наш взгляд, свидетельствуют о том, чтостимуляция ТФ KNOX3 необходима для специализации структур клубенька(становления «клубеньковой» идентичности, включая закладку несколькихпроводящих пучков). На основании экспериментов по подавлению исверхэкспрессии гена KNOX3 было установлено, что этот ТФ можетстимулировать биосинтез цитокининов, влияя на гены, кодирующиеферменты IPT3 и LOG1, LOG2. Более того, активация KNOX3 может бытьсвязана с развитием инфекционного процесса, поскольку у мутантов SGEFix-2 и SGEFix--5 по гену sym33, у которых не происходит выход бактерий изинфекционных нитей, увеличение экспрессии этого гена не наблюдается.Обобщая данные по изучению влияния фитогормонов цитокининов иауксинов, а также ТФ KNOX3 и WOX5 на развитие клубеньков у гороха,можно представить следующую последовательность событий развитиясимбиоза.
При инокуляции в ответ на выделение ризобиями Nod-факторов урастений гороха происходит первичная стимуляция продукции цитокининов(1 – 3 дпи) в эпидермисе и коре корня. Увеличение содержания цитокининовв коре корня приводит к ре-локализации белков PIN и локальномуувеличению содержания ауксинов. Увеличение концентрации ауксиновстимулирует экспрессию гена WOX5, что может приводить к инициации236развития боковых корней и примордиев клубеньков по одному и тому жерегуляторному пути.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
