Диссертация (1144752), страница 35
Текст из файла (страница 35)
Умутантов максимум был выявлен на 7-9 дпи, тогда как у растений Frisson - на11 дпи. Кроме того, у мутантов не было выявлено столь значительногоснижения экспрессии PsWOX5 к 15 дпи, как у растений дикого типа (рисунок75). Эти результаты свидетельствуют о наличии взаимной связи междуизменениями в системе CLV и экспрессией гена WOX5, который может бытьмишенью этой системы.225Рисунок 75.
Количественный анализ экспрессии гена PsWOX5усуперклубенькообразующих мутантов sym28 и sym29 методом ОТ-ПЦР вреальном времени (Osipova et al., 2012).Нельзя было исключить, что высокий уровень экспрессии гена WOX5былсвязансбольшейчисленностьюкорневыхклубеньковусуперклубенькообразующих мутантов по сравнению с растениями дикоготипа. В связи с этим нам необходимо было выяснить, может ли увеличениеэкспрессии гена WOX5 у суперклубенькообразующих мутантов быть связанос изменением экспрессии этого гена локально, то есть в отдельныхклубеньках.
С этой целью был проведен анализ локализации экспрессии генаWOX5 у суперклубенькообразующих мутантов гороха sym29 и sym28,несущих мутации в CLV1-подобном и CLV2 генах.5.5.3. Анализ локализации экспрессии гена WOX5 у гороха дикого типа исуперклубенькообразующих мутантов sym29 и sym28с нарушениемсистемы CLV.Для локального анализа экспрессии гена WOX5 при развитии клубенькову суперклубенькообразующих мутантов гороха sym29 и sym28 и растенийгороха дикого типа Frisson, растения трансформировали штаммом A.rhizogenes, содержащим конструкцию pМtWOX5::GUS. После инокуляции226таких трансгенных растений штаммом ризобий Rh. leguminosarum bv. viciaeCIAM1026 исследовали локализацию активности GUS в формирующихсяклубеньках на различных сроках после инокуляции.У суперклубенькообразующих мутантов sym29 и sym28 активность GUSв отдельных клубеньках была значительно более высокой, чем у растенийдикого типа на всех проанализированных стадиях развития клубенькаОсобенно заметными эти различия были на 21 дпи (рисунок 76) (Osipova etal., 2012).Рисунок 76.Локальный анализ экспрессии WOX5 c помощьюрепортерной конструкции (pMtWOX5::GUS) в клубеньках гороха дикоготипа (А) и мутантов sym29 (B) и sym28 (C) на 21 день после инокуляции(Osipova et al., 2012).В то время как у растений дикого типа активность WOX5 в клеткахклубенька к 21 дпи смещалась к периферии и сохранялась в основном вобласти окончания проводящих пучков, то у мутантов sym29 и sym28активность WOX5 на очень высоком уровне наблюдалась во всей внутреннейзоне клубенька (рисунок 76).Таким образом, сравнительный анализ локализации экспрессии генаWOX5 при развитии клубеньков у растений гороха дикого типа Frisson исуперклубенькообразующих мутантов sym29 и sym28 показал, что у мутантовзначительно увеличен уровень экспрессии WOX5 и область его экспрессии в227отдельных клубеньках, по сравнению с растениями дикого типа (Osipova etal., 2012).
Это позволило подтвердить предложенную нами ранее гипотезу отом, что экспрессия гена WOX5 при развитии клубенька регулируетсясистемой рецепторов CLV. При этом CLV1 и CLV2 регулируют экспрессиюгена WOX5 не только системно (у суперклубенькообразующих мутантовобразуется значительно больше клубеньков), но и локально (у мутантов поclv1-подобному и clv2 генам значительно увеличен уровень экспрессии генаWOX5 в отдельных клубеньках, по сравнению с диким типом).Следовательно,регуляторнаясистемаWOX-CLVможетконтролировать не только функционирование апикальных меристем побега икорня у растений, но и необходима для регуляции развития меристемыклубеньков, которая появляется de novo у гороха при симбиозе. При этомособенностью функционирования этой системы у бобовых растений являетсяспособность CLE-пептидов осуществлять регуляцию дистанционно (longdistance),посколькуонисинтезируютсявкорневойсистеме,новзаимодействуют с CLV1 и CLV2 рецепторами, локализованными в побеге.228Заключение по части 5.Полученные данныепозволяютпредложитьследующуюсхемусигнального обмена при системном регулировании растениями гороха числаформирующихся клубеньков.
Связывание Nod-факторов на поверхностикорней растений гороха вызывает активацию сигнального каскада, которыйвлияет на биосинтез цитокининов и, в конечном итоге, на ингибированиеполярного транспорта ауксинов и локальное накопление ауксинов вотдельных участках корня. Вероятно, увеличение концентрации ауксиноввызываетактивациюэкспрессиигенакоторыйWOX5,имеетнепосредственное отношение к процессу закладки примордиев/меристемыклубеньков.ТранскрипционныйстимулирующеевлияниерегуляторнаможетWOX5пролиферациюоказыватьклетокприклубенькообразовании, однако механизмы такого влияния еще предстоитвыяснить (Osipova et al., 2012).
На ранних этапах развития симбиоза у гороханаблюдается стимуляция экспрессии гена PsCLE13, который являетсянегативным регулятором клубенькообразования. Зависимость активацииэкспрессии гена PsCLE13 от компонентов сигнального каскада, запускаемогоNod-факторами, указывает на непосредственное участие этих сигнальныхмолекул в активации механизмов авторегуляции. Регуляторный пептид CLEчерез систему рецепторов CLAVATA запускает сигнальный путь, которыйподавляет экспрессию WOX5 на более позднем этапе развития симбиоза иингибирует дальнейший процесс формирования клубеньков.
При этомнегативное влияние CLE-пептида на клубенькообразование связано сподавлениемэкспрессииосновныхрегуляторов,контролирующихинициацию этого процесса у гороха таких, как Sym10 рецептор, а такжетранскрипционный фактор NIN, участвующий в передаче сигнала.Такимобразом,регуляторнаясистемаWOX-CLVможетконтролировать развитие меристемы клубеньков гороха, которая появляется229de novo при симбиозе.
При этом особенностью функционирования этойсистемы является способность CLE-пептидов осуществлять регуляциюдистанционно. Экспрессия гена WOX5 при клубенькообразовании такжерегулируется CLAVATA системой и CLE-пептидом, аналогично тому, каквзаимодействуют гены WUS/WOX и CLAVATA в апикальных меристемахпобега и корня у растений.230Заключение.На основании анализа экспрессии генов нодулинов PsEnod5 иPsEnod12a у серии мутантов гороха, характеризующихся нарушениемразвитиясимбиозанаразличныхстадиях,былиполученыэкспериментальные доказательства активации разных сигнальных путей приузнавании Nod-факторов.
Среди двух генов, исследованных нами, генPsEnod5регулируетсяболеестрогимобразом:дляегоактивациинеобходимы не только регуляторы «общего сигнального пути» Sym10,Sym19, Sym8 и Sym9, но также Sym35 (NIN), Sym14, Sym16 и Sym34. Дляиндукции экспрессии PsEnod5 необходим функциональный рецептор Sym37,который, по-видимому, активирует целую группу регуляторных генов,определяющих развитие более поздних этапов симбиоза, связанных синфекцией и органогенезом клубеньков. Эти данные свидетельствуют впользу предположения о том, что у гороха рецепция Nod-факторов можетконтролироваться разными рецепторными комплексами и осуществляется надвух последовательных этапах развития симбиоза – на преинфекционнойстадии и при развитии инфекционного процесса.В результате проведенных исследований были синтезированы рецепторподобные киназы Sym10 и Sym37 в гетерологичной (бактерии E.
coli) игомологичной (листья N. benthamiana) системах, что позволило наработатьэти белки в количестве,достаточном для анализа их связывающейспособности с Nod-факторами. Такой анализ для внеклеточных доменоврецепторов и полноразмерных рецепторов Sym10 и Sym37 выявил низкуюаффинностькNod-факторам.Этоуказывалонасуществованиедополнительных и еще не выявленных рецепторов с высокой аффинностью кNod-факторамвсоставерецепторныхкомплексов,узнавание растениями гороха этих сигнальных молекул.231контролирующихВозможным кандидатом на роль такого рецептора может бытьохарактеризованная нами новая LysM-рецептор-подобная киназа К1. Впользу этого свидетельствуют данные молекулярного докинга о способностиLysM-РПК К1 связывать Nod-фактор, а также результаты анализасвязывающейК1 способностис лигандом методом поверхностногоплазмонного резонанса.
Более того, мутанты по гену k1 характеризовалисьнарушением способности инициировать симбиоз с ризобиями. СпособностьLysM-РПК К1 формировать комплекс с белком Sym10 при ко-экспрессии влистьяхN.benthamiana,показываетвозможностьфизическоговзаимодействия двух белков. Формирование такого рецепторного комплексас К1, может являться необходимым для инициации развития симбиоза сризобиями.Нами впервые была охарактеризована рецептор-подобная киназа Lyk9 ипоказано ее участие в ответе растений на действие хитоолигосахаридов(ХОС) с разной степенью полимеризацииу гороха P. sativum L. Былопоказано, что у растений с подавленной экспрессией PsLyk9 с помощью РНКинтерференции в ответ на обработку ХОС (n = 5), выделяемых грибами АМ,наблюдалосьзначительноеснижениеэкспрессиигенов,являющихсямаркерами развития симбиоза с грибами АМ (DRP, PT4, DELLA, RAM1,NSP2, DWARF27 и TI).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
